3D细胞培养和类器官在骨髓源性间充质干细胞成骨分化中的研究进展

周子墨 柳达 陈森相 覃森

中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁 沈阳 110004

骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，根据诱导方式的不同，可以分化为神经元、软骨细胞、成骨细胞等[1-3]。当骨组织发生损伤后，损伤部位释放的因子诱导远处的BMSCs向损伤部位迁移，发生归巢效应，并定植于损伤部位。同时，BMSCs不断分化为成骨细胞，并释放多种细胞因子，促进新的骨组织生成，这一过程也被称为成骨分化(osteogenesis differentiation)[4]。因此，BMSCs的骨组织修复作用机制可分为3个方面：①多向分化；②旁分泌；③归巢效应。近年来，BMSCs的成骨分化在骨质疏松症、骨折、骨肉瘤等多种疾病中发挥重要作用，其相关的多种分子机制也不断被阐述[5-6]。

随着对干细胞研究的不断深入，大量研究已经证明干细胞可以沿着特定的组织谱进行自我增殖和分化。此外，从体内分离并在体外培养的干细胞在诱导下可以分化为特定的细胞，这为体外器官的构建提供了基础。近年来，3D培养技术的不断成熟，使得多种干细胞及肿瘤相关类器官模型被构建，这些模型具有构建所需时间短、遗传学稳定等特点，可以很好地还原相关疾病在体内的发生发展和分子遗传学特性，为研究疾病发病及其相关分子调控机制提供了很好的基础[7]。BMSCs作为一类多能分化干细胞，其潜在的体外增殖和分化能力受到关注。目前，对BMSCs的成骨分化研究主要集中在2D细胞培养，而这种简单的体外培养方式无法构建骨组织及机体内环境，极大限制了BMSCs的成骨分化研究。3D培养技术的发展使得BMSCs成骨分化相关类器官的构建成为可能，这一技术有望在骨质疏松症等骨代谢性疾病的发病机制研究、分子治疗、药物研发及组织工程等领域发挥重要作用。

1 类器官定义及发展

1.1 类器官的定义

早在1975年，Rheinwald等[8]通过角化细胞和3T3成纤维细胞的共培养，构建了类似于表皮的分层鳞状上皮细胞集落。近年来，随着3D培养技术的发展，类器官也被进一步描述为模仿哺乳动物原始组织的体内结构和多谱系分化干细胞形成的具有一定组织形态的三维结构[9]。3D培养技术模拟了干细胞生长所需的细胞外基质环境并提供了悬浮细胞培养条件，这一人工构建的微环境与体内微环境相似，包含多种与干细胞生物学行为相关的细胞及细胞因子等。干细胞在这一环境中受到微环境的调控，模拟在机体内发生的一系列生物学过程，并逐渐被诱导分化形成特定的、能够自组织的三维结构，这一特定组织结构也被称为干细胞龛(stem cell niche)，即类器官。类器官的构建及相关实验方式兼备了普通细胞培养、干细胞异体输注培养和自体组织切片的优点，为干细胞及肿瘤研究提供了更加灵活的手段。

1.2 类器官的发展

类器官在多种干细胞及肿瘤研究中发挥了重要的作用。Sato等[10]第一次通过在体外构建类器官培养环境，使得肠成体干细胞(ASCs)在类器官中稳定并自组织的形成隐绒毛类器官。在此基础上，研究人员制备出了多种组织的类器官，包括肠道、肾脏、肝脏、胃、肺等[7,11-14]。这些类器官均由不同类型的干细胞分化而来，如2013年，Takebe等[15]诱导多能干细胞(iPSCs)分化为肝脏类器官并移植入肠系膜，极大缓解了肝衰竭的进程。此外，胚胎干细胞(ESCs)可以诱导产生肺和脑等类器官[9,16]。干细胞的多能分化作用还体现在同种多能干细胞可分化为不同的类器官，如ASCs不仅可以分化为肠道类器官，还可以分化为肝脏、胰腺、肺等[17-19]。这也提示类器官的构建对3D培养环境的要求较高，适合的培养条件及环境对干细胞诱导极其重要。2005年，Braccini等[20]第一次描述了一种针对BMSCs的3D培养系统，可直接在3D环境中种植和分化BMSCs，其成骨效果较2D培养的BMSCs更好。

目前，除了构建不同组织的类器官，与类器官培养相关的技术也在不断发展。针对不同细胞类型的不同组织类器官，培养方案均有较大差异。针对乳腺癌的类器官培养，研究者将组织样本进行机械破坏和酶消化结合方法，制定了基础的培养方案。在此基础上，实验方案不断被优化，多种生物制剂被应用于乳腺癌的类器官的构建，大大提高了培养的成功率[21]。Wu等[22]发现在3D培养系统中提供合适的软骨微环境，如软骨细胞外基质后可以促进BMSCs的软骨分化。此外，对于3D培养使用的材料，也在不断发展。一种基于骨骼肌袋的生物材料培养系统被开发，用来支持干细胞的长期培养，并构成了一种新的类器官模型，为骨组织移植提供了可能[23]。

2 BMSCs成骨分化相关类器官的培养

类器官的3D培养环境对于其模型构建至关重要。类器官的自组织指干细胞在3D培养环境中从最初一个缺乏有序的结构，在系统性自主调控机制的指导下，进行空间重新排列的过程。自组织过程可分为两个阶段，一个是包括反应扩散机制、调控网络的双稳定性机制和不对称细胞分裂机制构成的自我模式(self-patterning)，主要由局部细胞间通讯介导；另一个是包括组织内不同类型细胞的聚类和更高层次的结构重组导致的类器官形态重排。自组织中，细胞的粘附作用、细胞运动、细胞形态和细胞间信号串扰(crosstalk)均发挥了重要的作用[24]。这一过程的影响因素可以概括为：①培养环境的理化特性；②系统内源和外源信号。

2.1 培养环境的理化特性

类器官的3D培养所需要的容器必须能支持细胞粘附和生长，一种从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提纯获得的基质胶(Matrigel)被作为细胞外基质广泛应用于3D培养中[9]。对于BMSCs的分化培养，有研究表明，相比于单纯涂有细胞外基质的藻酸盐微珠培养系统，添加有硫酸软骨素 (CS) 和 Col 2的培养体系可以更好的促进BMSCs的软骨分化[22]。

水凝胶作为一种新的生物材料，也被认为是Matrigel的替代品，其可以控制培养环境的理化特性及力学特性，并在BMSCs的成骨分化和类骨组织形成中发挥作用[25-27]。但水凝胶对于BMSCs的内器官形成作用依然有争议。传统基质中含有IGF、TGF/组织纤溶酶原激活物等复杂的生长因子，而水凝胶中则缺乏这些天然含有的生长因子[14]。Jaramillo等[28]将BMSCs加入合成水凝胶基质 (PEGDA)并植入成年雄性Lewis大鼠的回肠系膜，以期形成类牙齿器官，但由于缺乏基质相互作用，BMSCs无法和PEGDA相容。

此外，还有多种生物3D支架也被广泛开发用于BMSCs的体外3D培养[29-30]。Lastra等[31]开发了一种全新的由富马酸-醋酸乙烯酯共聚物和壳聚糖制备的微球环境，不仅可以促进BMSCs增殖，还可以促进其重新排列成簇生长，表明出良好的类骨组织生长。Abbasi等[32]构建了一种机械调节剂聚合物微粒MP，这种微粒使得人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)球体不断增殖和成骨分化，成为一类成骨分化类器官建模的新工具。

2.2 系统内源和外源信号

类器官的自组织需要多种细胞因子及信号的刺激。首先是由干细胞自分泌和旁分泌产生的内源信号，如外泌体、生长因子等。当干细胞聚集生长时，这些干细胞分泌出多种因子，激活并刺激更多干细胞的分化过程。一些类器官的产生几乎完全依赖于内源信号，例如，小鼠PSCs培养而来的小鼠视杯类器官需要在低生长因子水平的无血清培养基中培养，而PSCs自己产生的内源信号对视杯类器官的产生起到决定作用[33]。对于BMSCs的研究中我们发现，3D培养时，BMSCs分泌的外泌体可以激活周围BMSCs的HMGB1/AKT通路，从而对BMSCs的增殖、迁移影响较2D培养更强[34]。

其次，类器官自组织所需的外源信号包括外界给予的多种细胞因子和生长因子。在3D培养所提供的血清中，已含有一定量的生长因子，此外，BMSCs成骨分化所需要的抗坏血酸、β-磷酸甘油及一定剂量地塞米松等也会被添加入培养基中。Petrigliano等[35]在涂有成纤维细胞生长因子 (bFGF)的3D支架上培养BMSCs。实验表明，额外提供bFGF可以很好的促进BMSCs的生长分化。此外，一些研究通过在基质胶中加入Col I等促成骨分化因子，以进一步促进成骨分化的发生[36]。

在最初的增殖与分化中，外源信号发挥着重要作用，通过外源信号的刺激，内源性信号被激活，并发挥调控作用。因此，内源信号与外源信号在类器官的构建中均发挥了不可或缺的作用，这也为BMSCs成骨分化类器官提供了更多的研究方向，如改变外源信号的水平或者使用药物干扰内源信号的表达对类器官模型的影响及其相关分子机制[37]。

3 BMSCs成骨分化相关类器官的应用

目前，针对BMSCs的类器官构建依然较少。BMSCs的3D培养主要应用于组织工程和植入材料的开发，如优化的丝素蛋白明胶支架、透明质酸水凝胶支架等在BMSCs的软骨分化中可以起到促进作用，为软骨原位修复提供更多可能[26,38]。目前一些研究已经证实这些无机或有机材料制备的3D支架可以通过自身的特性，如接近机体骨骼的矿物质百分比、组成、结构以及力学性能，提供适合BMSCs生长的理化特性，以促进BMSCs的增殖、分化，这也为类器官的构建提供了很好的基础[39]。

临床上，已有研究通过3D培养技术构建牙齿及颅面骨的类器官，使得移植物在受损的颅面组织上移植后，能促进牙槽骨再生和颌骨重建，这种类器官的移植最适合由创伤、疾病或出生缺陷引起的口腔骨、皮肤和牙龈严重缺损，并在临床治疗中得到了较好的预后[40]。

而在其他如药物筛选和骨质疏松症疾病的基础研究等领域，3D培养更体现出优于2D细胞培养的特点。有研究通过3D培养构建牙周韧带间充质干细胞 (PDLSCs)团块，讨论脂多糖(LPS)对间充质干细胞增殖和成骨潜能的影响研究。结果表明，相较于2D平面培养的3D PDLSCs，3D培养的PDLSCs团块更能抵抗LPS的作用，降低炎症反应的发生[41]。此外，与2D塑料板上培养的MSCs相比，3D浮动培养的MSCs团块中环氧合酶2 (COX2)介导的PGE2产生显着增加，并且显著抑制了细胞的凋亡[42]。目前，针对MSCs的3D培养构建肝脏类器官模型并进行药物筛选及移植的研究已被广泛开展，但对于BMSCs成骨分化类器官的研究，依然十分有限。

4 总结与展望

3D细胞培养技术作为一种新的细胞培养手段，由于可以提供细胞生长所需的细胞外基质环境及悬浮细胞培养条件，使得其能更接近于人体的微环境。而干细胞的多向分化能力、旁分泌和归巢效应，则为3D培养及类器官模型的建立成为可能。因此，类器官模型的建立在生物医学领域有着广阔的应用前景。尽管BMSCs成骨分化的类器官模型已被构建并不断优化，且被应用于临床，但其依然存在许多限制。首先是与传统BMSCs培养相比，3D细胞培养过程较复杂，所需耗材昂贵，且技术不成熟等因素导致类器官构建成功率较低。此外，人体BMSCs的获得和扩大培养较困难，其涉及到的伦理问题也使得这一技术无法在大规模的药物筛查及基础实验中被利用。解决以上问题，还需要更深入的研究。

综上所述，BMSCs成骨分化的3D细胞培养及类器官的构建可以应用于骨质疏松症等多种疾病的药物筛查、基础研究及临床治疗相关的组织工程中。其特有的优势可以帮助研究人员更深层次的探讨BMSCs成骨分化相关机制与药物治疗，使骨代谢疾病的个体化治疗成为可能。