脉冲电磁场对新型低弹多孔钛合金表面成骨效应的影响研究

刘文文 杨巍

[摘要]目的：觀察脉冲电磁场刺激对新型低弹多孔钛合金支架表面的成骨效应。方法：使用3D打印技术制备多孔钛合金（Ti-24Nb-4Zr-8Sn，Ti2448）支架，并使用扫描电镜对支架的表面形貌进行观察;将成骨细胞接种于支架表面，给予脉冲电磁场刺激的支架为实验（PMEF）组，不给予脉冲电磁场刺激的支架为对照组;使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测两组细胞的增殖能力;使用活/死细胞染色观察两组细胞在支架上的活性;使用扫描电镜观察两组细胞在支架上的形态;通过实时定量PCR观察两组细胞相关成骨基因分化;通过兔股骨外侧髁缺损模型进行体内骨长入分析，分别使用荧光标记和Van Gieson染色观察两组支架的骨长入情况。结果：使用3D打印技术成功制备实验所需的多孔钛合金支架;PMEF组成骨细胞的增殖能力、细胞活性明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;PMEF组成骨细胞可见明显细胞伪足，细胞状态良好;PMEF组成骨细胞的成骨相关基因表达明显高于对照组（P<0.05）;术后4周和12周，PMEF组新生骨沉积速率（两种荧光间距）均高于对照组（P<0.05），Van Gieson染色发现PMEF组骨长入明显多于对照组（P<0.05）。结论：脉冲电磁场刺激和多孔Ti2448植入物的组合可为骨科、口腔和整形等领域的骨修复重建提供一种新方法和新思路。

[关键词]钛合金;脉冲电磁场;多孔材料;骨整合;成骨

Abstract： Objective  Observe the osteogenic effect of PEMF stimulation on the surface of the new low-elasticity porous titanium alloy scaffold. Methods  The new low-elasticity porous titanium alloy （Ti-24Nb-4Zr-8Sn， Ti2448） scaffolds were prepared by 3D printing technology. The surface morphology of the scaffolds were characterized by scanning electron microscopy （SEM）. The osteoblast-like cell line MC3T3-E1 was cultured in the absence （control） or presence of PEMF stimulation on porous Ti2448 disc surface， and the adhesion and proliferation of the cells were investigated by SEM， live/dead cell imaging kit and CCK-8 assay. Furthermore， the expression of osteogenesis-related genes was also examined by quantitative real-time PCR. The porous Ti2448 scaffolds for animal experiment were implanted into the lateral femoral epicondyle of female New Zealand white rabbits. All of the 24 rabbits were then randomly divided equally into two groups， one group with PEMF stimulation for 2 h everyday and the other with no stimulation as control. After 4 weeks and 12 weeks， fluorescent markers and Van Gieson staining were used to observe the bone ingrowth of the two groups of scaffolds. Results  The porous titanium alloy scaffolds required for the experiment were successfully prepared. The proliferation ability and cell activity of MC3T3-E1 in PMEF group were significantly higher than those in control group （P<0.05）. The cells in the PMEF group showed obvious cell pseudopodia， the osteoblast-related genes expression of cells in PMEF group were significantly higher than that in control group （P<0.05）. At 4 and 12 weeks after surgery， the rate of new bone deposition （two types of fluorescence spacing） in the PMEF group was higher than that in the control group （P<0.05）. Van Gieson staining showed that the bone growth in the PMEF group was significantly more than that in the control group （P<0.05）. Conclusion  The combination of PMEF and porous Ti2448 implant can provide a new idea for bone repair and reconstruction in the fields of orthopedics， oral cavity and plastic surgery.

Key words： titanium alloy; pulsed electromagnetic field; porous material; osseointegration; osteogenesis

多孔钛合金与实体钛合金相比能够明显改善植入物的骨整合，是近年金属植入物研究热点[1-3]。但是多孔钛合金（Ti6Al4V）孔隙结构内部骨长入不是十分理想，特别是体积较大多孔材料的中心骨长入较少[4-5]。而多孔Ti6Al4V材料骨长入不佳的可能原因为：①多孔结构的采用仅能降低钛合金部件表观弹性模量，而材料本身力学性能没有实质变化，与骨组织微观力学性能不匹配的问题依然存在[6];②正常骨组织具有压电效应，其力与电转换特性可将外界应力刺激转换为内部电磁信号，电信号对于骨修复与改建至关重要，而植入部位由于正常骨组织的缺失，无法产生骨修复所需的相应电磁信号[7-8]。为解决上述问题，本研究采用3D打印技术，以新型低弹性模量Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448）合金粉末制备新型低弹性模量多孔钛合金[9];同时，引入外源性脉冲电磁场（Pulsed electromagnetic fields，PEMF）进行干预，模拟正常骨组织产生的内源性电磁信号。本研究通过细胞学实验和动物骨缺损模型对PEMF促进多孔Ti2448合金材料内部的成骨效应进行观察，旨在为骨科、口腔和整形等领域的骨修复重建提供一种新方法和新思路。

1  材料和方法

1.1 多孔Ti2448植入物的制备及表征：使用3D打印的电子束熔融技术（Electron beam melting，EBM）制备实验所需的多孔Ti2448支架，其中体外实验为直径10mm，高3mm的多孔圆盘，体内实验为直径6mm，高10mm的多孔圆柱体。本研究所用支架由沈阳金属研究所制备。使用扫描电镜（FE-SEM;S-4800，Hitachi，Japan）观察支架表面形貌及其表面元素。使用Qualitative micro-computed tomography （Micro-CT）（Y. Cheetah，YXLON，Germany）对材料的孔隙结构进行检测。所有支架使用之前在121℃（103.4kPa）环境下进行高温高压灭菌。

1.2 细胞培养：成骨细胞（MC3T3-E1）在加有10%胎牛血清（Gibco）和抗生素（青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，Sigma）的α-MEM（Hyclone）培养基中培养，培养条件为含5% CO2的37℃温箱。

1.3 脉冲电磁场（PEMF）刺激系统：PEMF刺激系统由一个PEMF发生器和两个螺线管组成，他们以5cm的间隔放置在一条线上。将一个包含带有MC3T3-E1细胞的Ti2448圆盘的24孔培养板放置在两个螺线管之间。将螺线管连接到PEMF发生器（中国西安，FMMU，GHY-Ⅲ;中国专利号ZL02224739.4），以产生特定的开路输出波形PEMF，已证明对成骨有积极作用[10]。使用高斯计（455 DSP高斯计，美国Lake Shore Cryotronics型号）将螺线管两端的峰-峰磁场确定为20高斯。在对照组中，将培养板也放置在相同的螺线管之间，但没有输出波形。将PEMF组和对照组每天放置在螺线管之间2h。

1.4 CCK-8检测细胞增殖能力：将1ml等分试样的MC3T3-E1细胞悬液（1×105个细胞）接种到24孔培养板中的每个多孔Ti2448圆盘上。12h后，将圆盘用PBS洗涤3次，然后转移至每个孔中含1ml培养基的新培养板中。PEMF刺激1、4或7d后，按照Cell Counting Kit-8（CCK-8，Dojindo）的说明评估细胞增殖水平。使用分光光度计（Labsystems Dragon Wellscan Mk3）测量450nm处的吸光度。

1.5 活/死细胞染色检测细胞活性：激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM;Olympus Fluo View FV-1000）用于檢查接种在多孔Ti2448光盘表面上的MC3T3-E1细胞的活力。在PEMF刺激48h后，按照说明（绿色荧光为活细胞;红色荧光为死细胞;Life Technologies），用活/死细胞成像试剂盒对细胞染色，并使用CLSM成像。

1.6 扫描电镜观察细胞形态：将1ml细胞悬液的等分试样以1×105细胞/ml的密度接种到多孔Ti2448圆盘上。48h后，将圆盘用PBS轻轻清洗3次，然后在4℃的1ml 2.5%戊二醛溶液中固定过夜。将圆盘用PBS冲洗3次，并在一系列乙醇洗涤中脱水。将所有样品进行干燥，涂铂，并通过扫描电镜（Hitachi S-4800）进行观察。

1.7 成骨相关基因表达：使用实时PCR评估成骨相关基因的表达水平。将细胞以每孔1×105个细胞接种。培养4或7d后，使用Trizol试剂（TaKaRa）分离总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）将每个样品的RNA反转录为互补DNA（cDNA）。使用实时荧光定量PCR（Bio-Rad CFX96实时系统）和SYBR Premix Ex TaqⅡ定量检测成骨相关基因ALP（alkaline phosphatase），Col-1（type 1 collagen），OCN（osteocalcin），OPN（osteopontin），Runx2（runt-related transcription factor 2）和BMP-2（bone morphogenetic protein-2）的表达水平。表1列出了靶基因的引物。将β-actin基因表达作为参照。

1.8 兔股骨外侧髁缺损模型的建立：将24只新西兰白兔（3±0.5）kg随机分为两组，麻醉并暴露股骨外侧髁。制作直径6mm，高10mm的圆柱形缺陷，并随机植入Ti2448支架。每天将PEMF组暴露于PEMF刺激下2h，将对照组也置于未通电的线圈中而不暴露于PEMF。

1.9 顺序荧光染料标记：在处死动物前14d，肌肉注射四环素（50mg/kg），连续2d，1次/d;取材前2d，肌注钙黄绿素（8mg/kg）。

1.10 定量组织学分析：在第4周和12周通过耳静脉空气栓塞处死实验兔，并分离双侧股骨。在制备组织切片前，将样品固定2周（75%乙醇）。准备组织切片，并使用共聚焦激光扫描显微镜获得荧光色素标记图像，Image-Pro Plus 6.0软件用于定量分析新骨组织。同时，进行Van Gieson染色。检查所有染色的切片，并获得图像。使用image-Pro Plus 6.0软件计算新形成的骨骼的体积分数（骨骼体积/支架的总体积，BV/TV）并进行统计比较。

1.11 统计学分析：使用SPSS 20.0软件分析数据。采用单因素方差分析，再进行两次样本t检验，确定显著性水平。结果以（x?±s）表示。P<0.05被认为有显著差异，P<0.01被认为有高度显著差异。

2  结果

2.1 材料表面扫描电镜结果：通过扫描电镜检查多孔Ti2448圆盘的表面形态。由于金属粉末颗粒部分熔化到多孔Ti2448圆盘的支杆上，因此在支架上观察到一个粗糙的表面（见图1A～B）。对三个随机选择区域的表面进行能谱分析发现，Ti2448支架由Ti，Nb，Zr和Sn组成（见图1E和表2）。从体外及体内实验用的支架大体观可以发现，Ti2448支架呈金黄色，具有明显开放孔径结构（见图1C～D）。支架的孔径大小为（710±42）μm，孔隙率为（68±5.3）%。

2.2 两组细胞增殖能力比较：如图2所示，在培养1d后，在PEMF组和对照组间细胞粘附和增殖能力比较差异无统计学意义（P>0.05）。然而，在第4天和第7天，PEMF组的细胞数量显着高于对照组，PEMF组的吸光度分别较对照组高144%和126%（P<0.01）。

2.3 两组细胞活性比较：在对照组和PEMF组中，大多数具有绿色荧光（活细胞）的细胞都具有成骨细胞样的形状，并且延伸良好。在绿色细胞中检测到红色荧光的偶发斑点，代表死亡细胞。与对照组相比（见图3A～B），PEMF组观察到绿色荧光的细胞更多，红色荧光的细胞更少，且PEMF组中形成了更多的细胞簇（见图3C～D）。

2.4 兩组细胞形态比较：使用扫描电镜观察支架表面细胞形态。在低倍视野下，对照组（见图4A）支架表面细胞数量明显少于PEMF组（见图4C），且PEMF组支架表面细胞形成了明显的细胞簇。在高倍视野下，对照组（见图4B）细胞伸展状态明显较PEMF组（见图4D）差，且PEMF组细胞伪足更明显，更具有成骨样细胞的典型形态。

2.5 成骨相关基因表达：图5显示了成骨相关基因的表达水平，包括ALP，Col-1，OCN，OPN，Runx2和BMP-2。PEMF刺激通常会上调所有目标基因的mRNA水平。在第4天，对照组和PEMF组ALP和BMP-2的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05），但PEMF组的Col-1，OCN，OPN和Runx2 的mRNA的表达较对照组分别上调了1.3倍，3.3倍，1.7倍和1.4倍。在第7天，PEMF刺激后，ALP，Col-1，OCN，Runx2和BMP-2分别上调了4.2倍，1.9倍，2.0倍，1.3倍和4.0倍， 而对照组和PEMF组之间的OPN表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6 顺序荧光染料标记分析：荧光标记结果示如图6（100×）所示。在显微镜下，材料周围的新骨头在同一时间点以线性排列沉积。术后4周，PEMF组（见图6B）中多孔Ti2448周围四环素标记的（黄色荧光）新骨与钙黄绿素标记的（绿色荧光）新骨之间的间隔（45.37±6.29）μm大于对照组的（24.12±3.08）μm的间隔（见图6A），差异有统计学意义（P<0.05）;术后第12周，PEMF组（见图6D）材料周围荧光双标记新骨沉积的距离为（66.18±5.97）μm，也高于对照组[（41.45±4.25）μm，P<0.05，见图6C]，见图6E。

2.7 两组支架的Van Gieson染色分析结果：Van Gieson 染色结果如图7（10×）所示，可以发现新形成的骨（红色）直接从骨骼缺损的边界向支架内部发散。术后4周，对照组（见图7A）和PEMF组（见图7B）中的多孔Ti2448材料被新的骨骼组织包围，新骨与材料之间存在明显的间隙。在对照组中，只有少量不规则的新骨在多孔材料边缘形成，而PEMF组在材料边缘的中有更多的新骨，两组材料孔隙内部均为出现明显的新生骨。术后12周，两组多孔材料的新骨形成明显更多。与对照组（见图7C）相比，PEMF组（见图7D）有更多的骨进入材料内部。对照组中材料与新骨之间仍然存在很小的间隙。在PEMF组中，新骨和材料紧密结合，并且骨整合良好。进一步对骨体积分数进行对比发现，在4周和12周PEMF组的骨体积分数均明显大于对照组（P<0.05，见图7E）。

3  讨论

多孔钛合金因其在较好保留钛合金机械强度的同时具有更低的弹性模量和多孔特性，从而成为骨修复重建领域的优势材料[1]。随着金属3D打印技术的出现，不仅可以实现多孔钛合金材料的精确空间构型设计与制造，同时可以制备出仿真的个性化金属骨骼，达到骨缺损精准修复重建的目的，由此具有极为良好的应用前景。近年来，国内外先后研发出可应用于不用部位的多孔钛合金植入修复体并成功应用于临床。例如，国内张庆福等[3]采用EBM技术制备个体化3D打印多孔钛合金下颌骨修复体实现了下颌骨缺损的精确重建，获得了满意的外形和功能恢复效果。有学者[11]将EBM技术制备的3D打印多孔钛合金人工椎体应用于脊柱肿瘤切除后骨缺损修复，术后脊柱外形与功能得到良好重建。尽管多孔钛合金植入物取得了较好的早期临床效果，但是对于多孔钛合金内部骨形成不良和应力遮挡导致骨吸收的问题仍然是目前多孔钛合金临床应用亟待解决的问题。

多孔结构只是降低了钛合金材料的整体表观弹性模量，钛合金材料本身较高弹性模量并未得到实质改善，导致多孔钛合金内部孔隙之间依然存在应力遮挡效应，孔隙的应力依然由弹性模量高的金属小梁承受，引发的应力遮挡效应可以导致多孔材料内部骨吸收，影响材料内部骨整合，发生植入体松动[12]。因此，研发新型低弹钛合金，获得与人体组织更佳的力学匹配，一直是钛合金材料研发的热点。本研究采用的一种新型Ti2448合金，弹性模量仅42GPa，远低于目前临床常用Ti6Al4V合金的弹性模量（110GPa），经动物实验证实该新型低弹钛合金材料与传统Ti6Al4V合金相比能够显著减轻应力遮挡效应导致的骨吸收[13]。本研究以Ti2448合金为原材料，采用EBM技术进行3D打印制备，从而使多孔钛合金材料力学性能更好的匹配天然骨组织。当前对于支架的物理参数，如孔隙率、孔径大小以及孔径结构仍然没有统一的标准，这还需要在下一步的科研中进行优化。根据当前研究结果可以发现，随着孔隙率及孔径尺寸的增加，可长入材料内部的骨与血管的量会增加，但这会降低材料的力学强度，且过于开放的孔径结构不利于骨组织在材料支架上结合;同时如果孔隙率及孔径尺寸过小，虽然对维持材料的力学强度有明显优势，但是过小的孔径会使得细胞或骨组织在材料内部的迁移变得困难。综合当前的研究结果认为孔径400～1 200μm可以确保孔隙内部细胞保持足够活力[14-15]。本研究制備的支架材料孔径为（710±42）μm，对于促进骨组织向材料内部长入具有较好的优势。

天然骨组织可以通过机械应力改变产生电磁场，而此种微电磁环境对于骨修复和重塑的调控至关重要[16]。然而，由于各种原因造成的骨缺损会导致上述微电磁环境的缺失，这会使得植入物材料的成骨作用和骨整合不令人满意。因此有学者提出，在使用骨植入物时，应充分考虑模仿骨骼的微电磁特征[17]。根据之前的发现，PEMF刺激是实现此目的的一种有价值的方法[18]。自从Bassett于1974年发表报告称PEMF对骨不连骨折的有益作用以来[19]，PEMF在骨科的可能的用法和潜在机制中引起了极大的关注。许多研究表明，PEMF促进骨组织修复的作用主要是通过增加成骨细胞的活性，抑制骨重塑的吸收相，刺激钙化和增加血液供应来完成的。还有研究表明，PEMF对成骨细胞的粘附，增殖，分化和转录具有明显的促进作用。但是，PEMF对多孔钛合金支架骨形成的作用的研究未见报道。

Ti2448作为一种新开发的植入材料，应首先考虑其生物相容性。在本研究中，使用活/死细胞成像试剂盒直接确定了Ti2448支架上的细胞的活力。对照组和PEMF组中的大多数细胞均存活。SEM图像进一步表明，Ti2448支架表面上的细胞看起来很健康，并具有良好的细胞延伸性。以上所有结果表明，Ti2448合金具有高生物相容性和极低的细胞毒性。为进一步提高Ti2448植入物表面的成骨能力，使用PEMF对Ti2448支架表面细胞进行刺激。研究发现成骨相关基因在PEMF刺激下普遍的到了上调，同时PEMF也增加了Ti2448支架表面成骨细胞的增殖能力。随后又通过体内实验进一步证实这两种组合的骨再生效果。荧光标记和Van Gieson染色结果均证实，PEMF刺激可起到更好的骨整合和成骨作用。

综上，本研究结果为多孔Ti2448合金植入材料的临床应用提供了实验依据和理论基础，并有望为骨科、口腔和整形等领域骨缺损的修复重建提供一种新方法。最后，尽管本研究在体外和体内均证实了PEMF对多孔钛合金支架具有良好的促骨形成作用，但研究中仍尚有不足之处，例如PEMF刺激的参数优化以及PEMF促进多孔钛合金支架内部骨形成的机制等方面尚需下一步深入研究加以揭示。

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