白藜芦醇在骨关节炎中的作用及机制研究进展

褚云峰 于红燕 杨琪 彭艳斌 陈仲 刘明 于斐,3*

1. 北京大学深圳医院，广东 深圳 518036 2. 滨州市滨城区市立医院，山东 滨州 256600 3. 骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东 深圳 518036

骨关节炎(osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎，是一种以关节软骨退变及骨质增生为特征的常见慢性关节疾病。原发性OA可能由于软骨营养或代谢异常、应力不平衡、关节生化改变等因素造成，继发性OA可能由于关节结构异常、关节不稳定、损伤或机械性因素等造成。随着我国人口老龄化程度的不断加剧，OA患者的基数也越来越多，严重者可以造成残疾，给患者及卫生医疗带来沉重负担。近年研究显示，中药成分如白藜芦醇[1]、淫羊藿[2]、小檗碱[3]等，基因如沉默信息调节因子1(SIRT1)[4]、无翅型MMTV整合位点家族成员5A(Wnt5a)[5]、固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)[6]等均可对OA的进程产生影响，也因此广受关注。

白藜芦醇属天然抗氧化物质，在虎杖、花生、葡萄等植物中含量丰富。其存在顺式和反式两种同分异构体，自然界中主要以后者为主。国内外研究证实，白藜芦醇在骨科[7]、心血管[8]、肿瘤[9]等疾病中起重要作用，广泛应用于研究，并作为保健品被人群重视。此外，白藜芦醇能够通过核因子-κB(NF-κB)[10]、Toll样受体4(TLR4)[11]、细胞外信号调节激酶(ERK)[12]等通路作用于关节软骨并参与到OA的进展中。本文拟对白藜芦醇通过影响软骨衰老、软骨基质代谢、软骨损伤等作用参与OA的发生发展进程及NF-κB、TLR4、ERK等通路在其中的调控机制研究作一综述，为相关研究者提供参考。

1 白藜芦醇性质、发现及作用

白藜芦醇的化学式为C14H12O3，其化学名称为(E)-3,4’,5-三羟基二苯乙烯，相对分子量228.25。最初于1924年发现，并于1940年由日本科学家从毛叶藜芦的根茎中获得，在植物遇到不利影响时合成分泌增多，被称为植物抗毒素。白藜芦醇难溶于水，易溶于有机溶剂，熔点在253 ℃～ 255 ℃。365 nm紫外光照射可显示荧光，与三氯化铁-铁氰化钾及氨水等碱性溶液可起显色反应，从而用于白藜芦醇的鉴定。白藜芦醇药理作用多样，能够抗炎、抗氧化、抗菌及抗肿瘤等[13]。近年研究显示，白藜芦醇在骨科疾病如OA[14]、骨质疏松症[15]、神经损伤修复[16]中起着重要作用。

2 白藜芦醇在OA中对软骨功能的影响

关节软骨为透明软骨或纤维软骨，软骨组织由外到内依次为表层、移行层、辐射层和钙化层。关节软骨由软骨细胞和软骨基质构成，软骨细胞是其中唯一的细胞，基质主要为II型胶原和蛋白多糖。软骨维持正常结构对机体非常重要，当关节软骨出现退变，或者关节周围出现骨赘，可导致OA。

2.1 白藜芦醇对软骨衰老的影响

白藜芦醇是SIRT1基因的特异性激活剂，与衰老关系密切，白藜芦醇可通过激活SIRT1基因影响关节软骨的衰老进程。Mehta等[17]建立了老年人体外非酶糖基化诱导OA软骨移植模型，发现白藜芦醇在该模型中能有效抗衰老，可减缓年龄相关及糖尿病诱导的OA，并可用该模型评估年龄诱导的软骨生物力学变化。Hecht等[18]应用内质网应激驱动的I-ERS原发小鼠OA模型证实，内质网应激可诱发关节软骨退变，出现衰老、软骨细胞死亡、自噬阻滞和步态功能障碍等现象，白藜芦醇可通过降低内质网应激蛋白、TUNEL阳性软骨细胞数量和衰老标记物p16 INK4a等的表达减缓该现象。Qin等[19]则通过研究衰老和OA中常见的细胞内稳态机制-自噬现象证实，关节内注射白藜芦醇可以促进内侧半月板失稳诱导的OA模型中软骨自噬，这与AMP依赖的蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)信号通路密切相关。由此可知，白藜芦醇可对非酶糖基化、内质网应激、自噬等现象产生影响进而调控调控软骨组织及软骨细胞的衰老。

2.2 白藜芦醇对软骨基质代谢的影响

软骨遭到破坏时，基质金属蛋白酶(MMP)、解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等酶类升高。Yi等[20]培养OA患者的软骨细胞，经白藜芦醇处理后进行高通量测序等检测发现，白藜芦醇能抑制白介素1β(IL-1β)诱导的经NF-κB通路作用的炎症，降低MMP1/3/13和iNOS的表达，并增加II型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表达；Kang等[21]用兔软骨细胞检测也发现，白藜芦醇除了能够降低细胞中IL-1β刺激后MMP1/3/13外，同时降低了ADAMTS4/5表达，这一过程与白藜芦醇直接作用于细胞中的NF-κB通路相关。我们团队也发现，白藜芦醇作用于脂多糖(LPS)诱导的小鼠膝原代软骨细胞时，能够降低SREBP2、MMP13的表达，起保护软骨细胞的作用[22]。因此，白藜芦醇可以抑制软骨组织及软骨细胞中造成其基质降解的酶类的表达，并促进软骨特异性成分的分泌，而起到保护软骨的作用。

2.3 白藜芦醇对软骨损伤的影响

OA等骨科疾病中，软骨损伤已达到严重程度，加强对软骨损伤的研究也有重要意义。笔者团队的研究表明，采用微流控芯片筛选出携载114.28 μmol/L白藜芦醇的聚乳酸(PLA)/明胶材料比携载其他浓度的白藜芦醇更能够促进大鼠膝关节软骨缺损的修复，而且携载100 μmol/L白藜芦醇的PLA/明胶材料可能是通过PI3K/AKT 通路的作用促进其修复的[23-24]。Choi等[25]在体外使用白藜芦醇处理间充质干细胞(MSCs)，增强了其增殖能力并抑制其衰老，并且提高了其软骨生成物标记的表达，该类细胞在体内能够促进兔骨软骨缺损模型中透明软骨的再生。Bonifacio等[26]构建了结冷胶-蜂蜜-硅藻复合物这种缓释白藜芦醇的药物载体系统，发现该载体有利于白藜芦醇的控释，阻止细菌增殖和氧化应激损伤，并支持MSCs定植及朝向软骨细胞分化。胡雄彬等[27]制备了白藜芦醇三甲醚外用微乳凝胶，在木瓜蛋白酶注射建立的软骨损伤新西兰大白兔膝关节OA模型上局部外用，发现其能降低兔血清中IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达而改善关节缺损及溃疡，促进了膝OA软骨损伤的恢复。Chen等[28]在急性足肿胀模型基础上用胶原诱导建立大鼠关节炎模型，发现白藜芦醇、川芎嗪和姜黄素联合用药能够减轻大鼠足肿胀及踝关节结构、软骨、纤维组织的损伤，并且对胃无伤害，从而优于单一非甾体抗炎药的疗效。所以，白藜芦醇结合在各种材料如聚乳酸、明胶、结冷胶、壳聚糖中形成新型复合材料后，或者与川芎嗪、姜黄素等药物联用，可以通过影响BMSCs的增殖分化、抑制炎症等途径参与软骨损伤修复的进程。

3 白藜芦醇对OA的作用

OA是一种多因素引起的慢性退行性疾病，多条通路参与其中，比如NF-κB[10]、TLR4[11]、ERK[12]等，白藜芦醇可以通过激活或抑制通路中相关因子的表达，进而参与到OA中。

3.1 白藜芦醇通过NF-κB信号通路对OA的影响

炎症在OA中起着重要作用，而NF-κB通路是机体炎症调节的重要通路之一。Zhang等[29]发现，OA模型中肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)、NF-κB1、IL-6、MMP-13和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表达量升高，miR-9的表达量降低，白藜芦醇作用后能够逆转这些因子的表达，认为白藜芦醇可以通过MALAT1/miR-9/NF-κB信号通路减轻OA发生发展。Li等[30]证实，在颞下颌关节OA中，白藜芦醇连续注射能下调环氧合酶2(COX-2)/NF-κB/MMP的表达，增加软骨标志物，逆转下颌髁状突软骨细胞的慢性炎症，说明白藜芦醇可通过COX-2/NF-κB途径抗软骨细胞凋亡及抗氧化。Jin等[31]用小鼠软骨细胞系ATDC5进行了实验，发现LPS能通过激活NF-κB和p38 MAPK通路抑制该细胞的活力并诱导凋亡，增加IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，白藜芦醇预处理则降低了LPS的促凋亡及促炎症作用，miR-146b沉默则影响了白藜芦醇的作用，从而证实上调miR-146b导致的NF-κB和p38 MAPK通路失活是白藜芦醇起作用的途径。Wei等[32]认为，在大鼠OA模型中，白藜芦醇能够抑制TNF-α、IL-1β/6/18、Caspase-3/9、iNOS、NF-κB等的表达，并刺激血红素加氧酶1(HO-1)和核因子E2相关因子2(Nrf-2)的表达，表明白藜芦醇通过NF-κB和HO-1/Nrf-2通路改善OA大鼠模型中的炎症损伤并延缓OA进展。笔者团队也证实，经100 μmol/L白藜芦醇预处理的小鼠软骨细胞再受到LPS刺激时，NF-κB的核转位受抑制，并通过该通路降低TNF-α、IL-1β的表达，降低软骨细胞炎症并延缓其退变[33]。因此，白藜芦醇能够通过NF-κB信号通路影响到OA的炎症进程，它既能够降低炎症刺激时NF-κB信号通路的激活，又能够通过该通路降低炎症因子的表达，形成良性循环，影响OA病程。

3.2 白藜芦醇通过TLR4信号通路对OA的影响

TLR4是参与非特异性免疫的重要因子，是单个的跨膜非催化性蛋白质。Xu等[34]研究了白藜芦醇减轻肥胖相关的OA发生的机制，发现白藜芦醇能降低高脂饮食小鼠OA的发生，其中TLR4和PI3K/AKT通路均被调控，初步证实白藜芦醇可能通过激活PI3K/AKT通路进而抑制TLR4发挥抗OA作用。Jiang等[35]也研究了肥胖与OA的关系，通过灌胃给予白藜芦醇，改善了高脂喂养小鼠的OA症状，血清中IL-1β和瘦素水平降低，抑制了软骨中TLR4和肿瘤坏死因子相关蛋白6(TRAF6)表达，发现白藜芦醇可通过降低系统炎症水平及抑制软骨中的TLR4通路来减轻OA病理。Ma等[11]使用白藜芦醇二聚体Amurensin H治疗碘乙酸单钠诱导的小鼠模型发现，治疗2周能显著缓解软骨退变及炎症，并在细胞中发现该物质以时间和剂量依赖的方式抑制TLR4/ 脾酪氨酸激酶(Syk)通路和下游p65磷酸化和易位，阐述了Amurensin H通过TLR4/Syk/NF-κB途径保护软骨的作用。也有研究者使用50 μmol/L的白藜芦醇作用后进而观察TLR4 siRNA、PI3K抑制剂LY294002或转录因子叉头框蛋白O1(FoxO1)siRNA处理过的IL-1β诱导的骨肉瘤SW1353细胞，认为白藜芦醇作用下的SW1353细胞中存在TLR4/Akt/FoxO1炎症自限机制，进而发挥抗OA作用[36]。Gu等[37]认为白藜芦醇可以作为一种营养补充剂来对抗OA，他们使用IL-1β刺激的人关节软骨细胞研究发现，白藜芦醇可以降低该细胞活力，并导致TLR4以及与MMP13和IL-6合成相关的TLR4/髓样分化因子88(MyD88)依赖和非依赖信号通路的下游靶点显著上调。所以，肥胖导致关节负重增加等原因引起的OA可在白藜芦醇的介导下通过调控TLR4信号通路得到缓解，OA本身存在的炎症刺激及其影响下分泌的炎症因子也可以通过该通路的作用得到缓解。

3.3 白藜芦醇通过ERK信号通路对OA的影响

MAPK因子是能被细胞因子、神经递质、激素等因子激活的蛋白激酶，可在所有真核细胞中表达，该通路中研究最广的是ERK1/ERK2 (p42/p44)激酶。Shakibaei等[38]认为，白藜芦醇和姜黄素联用，能抑制IL-1β和MAPK途径特异性抑制剂U0126诱导的人关节软骨细胞凋亡以及导致β1整合素和ERK1/2的下调，进而说明两种天然化合物能激活MEK/ERK信号通路维持软骨细胞分化和存活。Abed等[39]则对OA中的软骨下骨进行了研究，他们用全膝关节置换术OA患者的胫骨平台软骨下骨板或尸检时正常人的胫骨平台制备原代成骨细胞，发现白藜芦醇能上调SIRT1表达及其活性，降低瘦素表达，增加ERK1/2磷酸化及OA成骨细胞矿化，并影响Wnt/β-catenin通路中Wnt3a的反应，说明白藜芦醇通过ERK1/2和Wnt/β-catenin通路对OA成骨细胞表型和活性起到有益作用。He等[12]研究SIRT1基因对OA软骨细胞凋亡和细胞外基质降解时，使用白藜芦醇刺激细胞，降低了细胞中MMP1/13、ERK、c-Jun N-末端激酶及p38激酶表达，白藜芦醇加用SIRT1 siRNA则逆转这些表达，发现了SIRT1基因抑制OA软骨细胞凋亡及细胞外基质降解的机制。Liu等[40]使用白藜芦醇处理晚期糖基化终末产物(AGEs)刺激的猪软骨细胞和软骨外植体，发现白藜芦醇抑制了AGEs刺激后细胞中炎症因子iNOS、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)等的表达，并认为与KK-IκBα-NF-κB和JNK/ERK-AP-1通路相关。由此可知，ERK信号通路在白藜芦醇缓解OA进程中也有一定作用，而这个过程与软骨细胞的增殖、分化、表型维持，调控软骨下骨的矿化，降低组织中炎症因子的表达以及抑制软骨基质的分解等密切相关。

4 小结与展望

OA与衰老、肥胖、创伤、遗传等多因素相关，治疗不及时可导致患者肢体功能障碍，甚至残疾。该病在50岁以上人群中好发，90 %的80岁以上老年人有OA的影像学表现。随着我国人口老龄化程度的不断加剧，OA患者会越来越多，其造成的医疗负担也会不断加剧，因此加强对OA的治疗迫在眉睫。白藜芦醇是一种容易获得的非黄酮类多酚有机天然化合物，其抗炎、抗氧化等作用可以通过影响软骨衰老、软骨基质代谢、软骨损伤等作用参与OA的进程，这一过程可能与NF-κB、TLR4、ERK等信号通路相关。但在以往的研究中，学者更多的是关注白藜芦醇单药对软骨组织某功能的单一影响、从而解释白藜芦醇对软骨破坏的影响进而延伸到OA的进程中，缺乏从软骨到软骨下骨整个层面的宏观解释以及软骨衰老、基质代谢和损伤等多功能层面的阐述，并且多数研究只通过单一的经典信号通路阐述白藜芦醇在OA发病机制中的作用，造成了片面性。笔者认为，从整体角度及多功能层面出发，将白藜芦醇负载于生物活性材料中，或者在添加白藜芦醇的同时联合其他药物或基因层面的改变、并结合单细胞测序或高通量测序等新兴技术研究白藜芦醇对OA的影响及机制，或许是一个可行的新出发点。鉴于此，加强白藜芦醇对OA治疗的研究，可能有利于为临床治疗OA提供潜在药物，最终造福于患者。