鸡白细胞介素18单克隆抗体的制备与鉴定

郑孟加，马 萌，王永强，高 丽，曹 红，李淑芹，李晓齐，郑世军

(中国农业大学动物医学院 农业农村部动物流行病学重点实验室，北京 海淀 100193)

1995年，Okamura等从中毒休克的小鼠肝脏中分离到1种可以诱导Th细胞和NK细胞产生γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的物质，被称为IFN-γ诱生因子(IFN-gamma-inducing factor,IGIF)[1]。1996年，Ushio等将其正式命名为白介素18(Interleukin-18,IL-18)[2]。IL-18是重要的免疫调节分子，通常以前体的状态存在于细胞内部，当机体受到细菌或病毒刺激时，其前体会被炎性小体切割形成有活性的IL-18并释放到胞外[3]，因此IL-18可以作为检测炎性小体介导的细胞焦亡的重要指标，也是检测先天性免疫应答炎症反应的重要指标。鸡IL-18与人和小鼠IL-18氨基酸同源性分别为34%和27%，目前国内外用于检测chIL-18的商品化单克隆抗体或试剂盒较为罕见。为此，本试验制备了抗chIL-18单克隆抗体，为深入研究chIL-18的生物学功能及炎性小体细胞焦亡的检测打下基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细菌种类、蛋白、细胞类型和实验动物 pGEX-6p-1、pET-28a两种质粒，大肠埃希菌(E.coli)BL21/DH5α，标签蛋白His-IL-1、His-IFN-β、His-IL-10，骨髓瘤细胞SP2/0，均为本实验室留存；6～8周龄BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2021—0006。

1.2 主要试剂与仪器设备 限制性内切酶，购自NEB公司；DNA胶回收试剂盒，购自Zymo公司；DNA连接酶和蛋白Marker,购自TaKaRa有限公司；Ni-NTA亲和纯化柱,购自德国Qiagen公司；凝胶Glutathione Sephrose 4B，购自GE Healthcare BioSciences AB公司；质粒快速提取试剂盒，购自北京艾德莱公司；鼠源抗His、GST单克隆抗体，购自Abmart公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG，购自鼎国昌盛公司；弗氏完全/不完全佐剂、HAT、HT、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鉴定试剂盒、DMEM粉剂、胎牛血清、DMSO和HEPES，均购自Cibco公司。凝胶成像分析仪，购自美国Alpha公司；96孔酶标仪，购自TECAN公司；低温冷冻高速离心机，购自Eppendorf公司。

1.3 chIL-18重组质粒的构建及蛋白表达 根据NCBI上发表的chIL-18的序列(GenBank ID：AJ277865.1)设计特异性引物：F1(5′-ATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R1(5′-TCATAGGTTGTGCCTT-TCATTA-3′)，以感染沙门菌的鸡脾细胞制备的cDNA为模板，扩增chIL-18基因；将扩增得到的特异性条带回收后连接至T载体，并设计含有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物F2(5′-GGATCCATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R2(5′-CTCGA-GTCATAGGTTGTGCCTTTCAT-3′)，以测序正确的质粒为模板对chIL-18基因进行扩增；利用双酶切方法将chIL-18基因连接到pET-28a和pGEX-6p-1载体上，转入大肠埃希菌DH5α，随后对重组质粒进行PCR扩增和测序鉴定。将构建成功的重组质粒分别转导入大肠埃希菌BL21中，加入IPTG对其进行诱导表达，对产生的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定，随后利用亲和层析法纯化鉴定正确的蛋白，高纯度的2种蛋白分别用作小鼠免疫和阳性杂交瘤细胞筛选的抗原。

1.4 chIL-18单克隆抗体的制备与纯化 免疫小鼠3次后，以间接ELISA方法检测小鼠chIL-18阳性血清效价水平，效价足够高的小鼠脾细胞可用来进行细胞融合。小鼠免疫程序参照参考文献[4]进行，细胞融合、阳性杂交瘤筛选过程参照参考文献[5]进行。单抗的大量制备与纯化参照参考文献[6]所述方法进行。

1.5 chIL-18单克隆抗体的鉴定

1.5.1 单克隆抗体亚型的鉴定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents说明书测定单克隆抗体亚型。

1.5.2 单克隆抗体亲和力的鉴定 利用间接ELISA方法测定单克隆抗体的亲和力，以1 μg/mL重组蛋白GST-chIL-18为包被抗原，将待检测的单克隆抗体加入其中，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG，使用酶标仪测定OD450处吸光值。数据的计算和分析参照参考文献[7]的方法进行。

1.5.3 单克隆抗体交叉反应性的鉴定 以原核系统表达的His-chIL-18、His-chIL-1、His-chIL-10、His-IFN-β蛋白为抗原，一抗以制备好的2株chIL-18单克隆抗体和His-tag单克隆抗体，二抗使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG进行Western blot试验，检测单抗的交叉反应性。

1.5.4 单克隆抗体抗原识别区域的鉴定 分别以chIL-18 N端第57位和第113位氨基酸为截点，构建3个chIL-18的截短重组质粒。以大肠埃希菌 BL21中诱导表达的截短蛋白为抗原，以制备的chIL-18单克隆抗体为一抗，使用Western blot方法鉴定2株单克隆抗体的氨基酸识别区域。

2 结果

2.1 chIL-18重组质粒的构建及蛋白表达 所构建的重组质粒经PCR鉴定、基因测序，所得结果与预期一致(图1A～1C)。重组质粒在E.coliBL21中诱导表达后，经SDS-PAGE分析(图1D和1E)及Western blot鉴定(图1F和1G)，确定His-chIL-18和GST-chIL-18重组蛋白均在预期目的蛋白大小处有表达。

图1 重组质粒的构建与蛋白的表达

2.2 chIL-18单克隆抗体的制备与纯化 免疫小鼠3次后，测定小鼠血清中chIL-18抗体效价达到1∶64 000。经过细胞融合、阳性杂交瘤筛选、亚克隆等过程，筛选到2株稳定分泌chIL-18蛋白抗体的杂交瘤细胞株，将其分别称作2A7和2G5。将筛选的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔中，利用盐析法和亲和层析法对抽取后的腹水进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体(图2)。

图2 单克隆抗体的纯化

2.3 chIL-8单克隆抗体的鉴定

2.3.1 单克隆抗体亚型的鉴定 使用 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 试剂盒检测，结果显示2株单克隆抗体的亚型均是IgG1型。

2.3.2 单克隆抗体亲和力的鉴定 利用间接ELISA方法对单抗的亲和力进行鉴定，结果显示2A7和2G5的亲和力解离常数(Kd)分别为4.4×10-12和2.06×10-10(图3)，表明亲和力良好。

图3 单克隆抗体2A7(A)和2G5(B)亲和力的鉴定

2.3.3 单克隆抗体交叉反应性的鉴定 使用Western blot检测方法测定单抗对原核系统表达的其他细胞因子识别情况，结果显示2株单抗都能识别His-chIL-18，但是不识别带有His标签的chIL-1、chIL-10、chIFN-β的蛋白，无交叉反应性(图4)。

图4 单克隆抗体交叉反应性的鉴定

2.3.4 单克隆抗体抗原识别区域的鉴定 抗原为mchIL-18截短蛋白，一抗为制备单克隆抗体，使用Western blot方法确定单克隆抗体的氨基酸识别区域。结果显示，2A7和2G5分别识别mchIL-18蛋白N端的第57～113位和第114～169位氨基酸(图5)。

图5 单克隆抗体抗原识别区的鉴定

3 讨论

人和小鼠IL-18成熟蛋白均由157个氨基酸组成，无信号肽和糖基化位点，它们之间氨基酸同源性为60%[8-9]。chIL-18基因位于第24号染色体上，成熟蛋白由169个氨基酸组成，与人和小鼠等哺乳动物相比肽链较长，其功能与人IL-18相似[10]。经分析，chIL-18与人IL-18和小鼠IL-18氨基酸同源性仅分别为34%和28%，因此推测chIL-18抗体不能识别哺乳动物的IL-18蛋白。

获得的2株杂交瘤均分泌高亲合力抗体，而高亲和力抗体识别不同抗原表位是制备夹心ELISA试剂盒的必备条件。抗原表位是由5～7个氨基酸组成的特殊化学基团[11]，为了鉴定单抗的抗原识别区，本试验构建了chIL-18的3个截短蛋白，分别为chIL-18的1～57 aa、58～113 aa和114～169 aa，结果表明这2株抗体可以识别不同的抗原表位，这为chIL-18双抗体夹心ELISA检测方法的建立和深入研究家禽先天性免疫炎症反应提供了有价值的手段。