苏木素与硼砂卡红两种染色方法对4种吸虫染色效果比较

陆 静，吴敬泽，冀 煜，王文龙，高珍珍

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

寄生虫玻片标本是寄生虫学中研究寄生虫微观内部结构的重要方法，用以补充自然状态下观察的不足，好的玻片标本也可以长期保存，具有重要的研究价值[1]。自然状态下观察，不易看清寄生虫的微细结构，因此，染色是玻片制作的关键环节，决定着玻片标本的质量。虫体内不同组织的细胞组成和化学成分不同，对不同染料的亲和力也不同，经不同染色方法可以呈现其内部不同细胞和组织的形态结构。最佳效果是经过染色后虫体不同部位、不同组织间呈现出一定的颜色差异，这样才有利于更清晰地观察和区分不同器官和组织的形态和结构[2]。

本试验分别用苏木素染色法和硼砂卡红染色法对肝片吸虫、胰阔盘吸虫、鹿前后盘吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫这4种吸虫进行染色观察比较，对传统制作方法[3-6]的不足之处加以改进，对4种吸虫永久性玻片标本制作方法进行探索，力求找到最适合这4种吸虫的染色条件，建立简便快捷、层次分明、辨识度高、效果良好的吸虫玻片标本染色方法。

1 材料与方法

1.1 材料 本试验所需吸虫，取自内蒙古农业大学兽医学院寄生虫标本室保存的吸虫标本。

1.2 主要试剂 丁香油，购自福晨(天津)化学试剂有限公司；甲醇，购自天津永晟精细化工有限公司；乙醇、醋酸，均购自天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司；苏木素、卡红，均购自Sigma-aldrich；中性树胶、盐酸、硼砂、硫酸铝钾，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器 玻片扫描仪，蔡司远东有限公司，Axio Scan.Z1；显微镜，蔡司远东有限公司，PRIMOSTAR；水浴锅，金坛市鑫鑫实验仪器有限公司，HH-1；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司，DHP-9011；天平，上海佑科仪器仪表有限公司，YP5002。

1.4 试剂配制 苏木素染液配制：苏木素2.5 g，100%乙醇25 mL，钾明矾2.5 g，氧化汞1.2 g，冰乙酸20 mL，蒸馏水500 mL。先将苏木素溶于乙醇中(稍加热)，将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，然后将其加热使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，防止溶液溅出，再煮沸2 min后将烧瓶立即浸入冷水中。当染液冷却后，加入冰乙酸，室温保存，用前过滤[7]。

硼砂卡红染色液配制：将硼砂研磨后制备成4%硼砂水溶液，取100 mL该溶液加入1 g研磨充分的卡红，在水浴锅中加热至卡红完全溶解后，再加入70%乙醇100 mL，经过24 h后，将硼砂卡红染色液过滤后放入棕色瓶中备用[8]。

1%酸酒精配制：将1 mL盐酸溶于99 mL 70%乙醇中。

巴氏液配制：将8 g氯化钠溶于30 mL福尔马林中，加蒸馏水至1 000 mL。

1.5 苏木素染色方法

1.5.1 染色 将固定于巴氏液中的虫体取出，用自来水反复冲洗45 min，将虫体置于平皿中晃动，并不停换水，过程中动作一定要轻，以防虫体损坏，再用蒸馏水迅速冲洗数次，将清洗好的虫体置于苏木素染液中12 h。

1.5.2 脱水 染色后的虫体分别移入30%、40%、50%、60%和70%乙醇中脱水各1 h，用酸酒精褪色20 min，取出后放入70%乙醇中冲洗，洗去虫体周围浮色，然后将虫体分别移入各浓度梯度乙醇(80%、90%、95%和100%)中继续脱水各1 h[9-10]。

1.5.3 透明 将无水乙醇中的虫体挑出后，移入无水乙醇和丁香油原液比例为1∶1的透明液中透明(肝片吸虫和胰阔盘吸虫1 h,鹿前后盘吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫30 min)，再用丁香油原液各透明1 h。

1.5.4 封片 用挑虫针轻轻挑取透明后的虫体放在已洗净的载玻片上，距离磨砂面约2.5 cm处，用挑虫针调整虫体，使虫体尽量平直，然后在虫体处滴加适量中性树胶，用盖玻片封片，将制备好的玻片平放在载玻片架上，将其放入37 ℃温箱中直至排净气泡，取出后室温阴干。

1.6 硼砂卡红染色方法

1.6.1 染色 冲洗虫体的步骤同1.5.1。将清洗好的虫体置于硼砂卡红染液中染色(肝片吸虫和胰阔盘吸虫24 h，鹿前后盘吸虫18 h，土耳其斯坦东毕吸虫12 h)。

1.6.2 脱水 染色后的虫体在30%、40%、50%、60%和70%的乙醇中分别脱水(鹿前后盘吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫45 min，肝片吸虫和胰阔盘吸虫1 h)，移入酸酒精中脱色30 s，取出虫体放入70%乙醇中冲洗，洗去虫体周围浮色，然后将虫体移入各级乙醇(80%、90%、95%和100%)中继续脱水45 min。

1.6.3 透明 同1.5.3。

1.6.4 封片 同1.5.4。

2 结果

2.1 肝片吸虫苏木素染色方法 肝片吸虫苏木素染色镜检为紫黄色，柳叶状，子宫黄染、结构完整、立体感强，其内部充满大量黑染的虫卵，虫卵的形状和走向清晰可见(图1A)。卵巢为深紫色，与卵黄腺、中段肠管、卵模界限清晰，易于分辨(图1B)。口吸盘和虫体前端肠管结构清晰(图1C)。雄茎囊和贮精囊结构清晰，染色后颜色不同，易于分辨(图1D)。

图1 肝片吸虫苏木素染色

2.2 肝片吸虫硼砂卡红染色方法 肝片吸虫硼砂卡红染色镜检为红黄色，柳叶状，子宫黑染、结构完整、立体感强，其内部充满大量虫卵，虫卵不易观察(图2A)。卵巢为粉色，与卵黄腺、中段肠管、卵模界限不清晰，不易分辨(图2B)。口吸盘和虫体前端肠管结构清晰(图2C)。雄茎囊和贮精囊结构模糊(图2D)。

图2 肝片吸虫硼砂卡红染色

2.3 胰阔盘吸虫苏木素染色方法 胰阔盘吸虫苏木素染色镜检为紫褐色，口吸盘和腹吸盘黄染，结构清楚(图3A)。子宫盘曲于虫体后部，内充满虫卵，子宫染色后颜色的深浅可以判断虫卵的成熟度和子宫的走向；卵黄腺褐色，位于虫体中部两侧，与子宫染色不同，易于分辨(图3B)。卵巢和睾丸深褐色(图3C)。雄茎囊黄染呈长管状，位于腹吸盘前方，雄茎囊内的贮精囊、前列腺等组织器官结构层次清晰；咽、食道和盲肠之间边界清晰，易看清各部结构；生殖孔开口于肠管分支的后方，虫卵从此口排出(图3D)。

图3 胰阔盘吸虫苏木素染色

2.4 胰阔盘吸虫硼砂卡红染色方法 胰阔盘吸虫硼砂卡红染色镜检为红色，口吸盘和腹吸盘红染，结构清楚(图4A)。子宫盘曲于虫体后部，内充满虫卵，子宫染色后颜色的深浅可以判断虫卵的成熟度和子宫的走向；卵黄腺褐色，位于虫体中部两侧，与子宫染色不同，易于分辨(图4B)。卵巢和睾丸深红色(图4C)。肠管、雄茎囊、贮精囊、前列腺、生殖孔等组织器官粉染，之间边界不清晰，不易看清各部结构(图4D)。

图4 胰阔盘吸虫硼砂卡红染色

2.5 鹿前后盘吸虫苏木素染色方法 鹿前后盘吸虫苏木素染色镜检为紫红色，虫体内部器官色差大(图5A)。口吸盘、食道和肠管与周围其他组织器官边界清晰；生殖孔结构清晰(图5B)。2个椭圆形睾丸前后排列于虫体中部，呈紫色(图5C)。紫色的卵巢颜色较深，和淡紫色的卵黄腺易于区分(图5D)。

图5 鹿前后盘吸虫苏木素染色

2.6 鹿前后盘吸虫硼砂卡红染色方法 鹿前后盘吸虫硼砂卡红染色镜检为黄色，虫体内部器官色差不大(图6A)。口吸盘、食道和肠管轮廓清晰；生殖孔结构不清晰(图6B)。2个椭圆形睾丸前后排列于虫体中部(图6C)。卵巢、卵黄腺模糊，不易区分(图6D)。

图6 鹿前后盘吸虫硼砂卡红染色

2.7 土耳其斯坦东毕吸虫苏木素染色方法 土耳其斯坦东毕吸虫苏木素染色镜检为紫色(图7A)。睾丸呈椭圆形，78～80个，苏木素染色后为深紫色，与周围其他组织器官界限分明，立体感强，易于观察(图7B)。抱雌沟结构分明，雌虫在抱雌沟内颜色与其不同，易于分辨(图7C)。清晰可见食道在腹吸盘前方分为2条肠支(图7D)。

2.8 土耳其斯坦东毕吸虫硼砂卡红染色方法 土耳其斯坦东毕吸虫硼砂卡红染色镜检为粉色，口吸盘和腹吸盘清晰可见(图8A)。睾丸染色后颜色与周围组织相同，不易分辨(图8B)。腹吸盘开始至虫体后端的两侧体壁向腹面卷曲形成“抱雌沟”，抱雌沟结构清晰(图8C)。可见食道在腹吸盘前方分为2条肠支(图8D)。

图8 土耳其斯坦东毕吸虫硼砂卡红染色

3 讨论

吸虫除分体吸虫外，皆雌雄同体[11]。吸虫主要的形态构造包括口吸盘、腹吸盘、生殖系统和消化系统[12-13]。形态学检验仍然是临床实验室最快捷简便、经济实用的常规检验方法，染色是形态学检验常用方法之一[14]。吸虫永久玻片标本制作方法的文献报道很少，经查阅其他染色方法的文献，苏木素是一种比较常见的碱性、永久性染色剂。本试验发现苏木素染液渗透与着色能力强，需要较长时间脱色，且染色后的组织器官明显，虫体清晰。硼砂卡红染液渗透性不强，染色能力较弱，颜色均匀。

染色是一个复杂的过程，染色的效果和染色时间长短需依据染剂对组织的染色作用、实验室温度、虫体大小、厚薄、固定液的选择、染液放置的时间长短等因素进行调节[15]。较大的虫体可适当延长染色时间，使其充分染色、均匀染色，与此同时脱水和透明时间也要相应延长，试验证明延长脱水和透明时间对标本染色没有不良影响。组织脱水时应逐步进行，通过逐级提高乙醇浓度将水分脱净，该过程不能操之过急，否则会引起组织强烈收缩，使虫体发生变形。在本试验过程中就出现了标本表面有层雾状膜的现象，原因主要是脱水、透明等步骤不够彻底。如果出现这种现象，必须立即更换100%乙醇脱水，继续透明。

本试验结果表明，同一种虫体苏木素染色方法较硼砂卡红染色方法用时短，苏木素染色4种吸虫的效果更佳。对于个别大且厚的吸虫，染色时间和透明时间可以延长。