黑斑蛙重盘吸虫的线粒体基因组特征及其系统发育研究

李宗宪， 李寄仟， 徐伟江, 2， 范丽仙, 2*

(1. 云南师范大学生命科学学院，昆明650500； 2. 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，昆明650500)

黑斑蛙重盘吸虫隶属复殖亚纲Digenea同盘总科Paramphistomoidea Fischoeder, 1901重盘科Diplodiscidae Cohn, 1904重盘属Diesing, 1836。汪溥钦(1977)首次于黑斑蛙消化道中检获并命名为黑斑蛙重盘吸虫，高利宾(2007)在泽蛙肠道内也记录了该种吸虫自然寄生。黑斑蛙重盘吸虫主要于江西、福建等地被报道，迄今仅见形态分类学研究(高利宾，2007；周庆安，2013)。

复殖吸虫系统发育研究大多基于核基因小分子片段(18S、28S和ITS 1-5.8S-ITS 2 rDNA联合序列)和线粒体(Littlewood & Olson，2001；Razo-Mendivil.，2004，2006；Laidemitt.，2017；丁健等，2018；李寄仟等，2020)。这些分子标记较短、所含信息量难以全面呈现物种各分类阶元的关系。扁形动物的线粒体DNA进化速率是核基因单拷贝速率的5～10倍，相比单基因承载了更多的信息量，比任何1个相对较短的DNA序列具有更多、更广泛的特征(Boore，1999；Arnason.，2007；张娟，2011；Locke.，2018)。因此，线粒体基因组已被用作物种的准确鉴定依据，基于线粒体基因组对吸虫的系统学研究表明，线粒体基因组对研究吸虫的种间和种内变异具有更高可信度，在分子诊断学、系统分类学、基因进化和物种进化等方面也体现较大潜力(Le.，2002；Littlewood，2008；Hegedusova.，2014；Ma.，2015，2017；聂宗恒等，2018；许姝歆等，2019)。

本文首次报道了重盘科吸虫线粒体基因组，补充了该类吸虫的遗传学数据，并揭示了其线粒体基因组特征，为后续开展基于线粒体基因组学的流行病学和系统发育研究提供新的基础资料。

1 材料与方法

1.1 吸虫的采集

宿主滇蛙捕获于云南省曲靖市陆良县寨子山(103°30′2.81″E，25°3′54.66″N，海拔1 958 m)。将宿主双毁髓处死，收集消化道内的吸虫，部分做成装片。

1.2 DNA的提取与线粒体基因组的获取

根据D3399-01石蜡DNA试剂盒说明书步骤提取总DNA。线粒体基因组由北京擎科生物科技有限公司通过二代测序获得，包括构建文库、测序、clean reads、组装和比对等流程。

1.3 线粒体基因组注释和数据分析

tRNA通过ARWEN(Laslett & Canbck，2008)和tRNAscan-SE 2.0(Lowe & Chan，2016)注释，蛋白编码基因和rRNA通过Mitos(Brent.，2013)注释。采用PhyloSuite(Zhang.，2020)计算密码子使用、同义密码子相对使用度，使用R语言ggplot2(Wilkinson，2011)可视化。

1.4 系统发育分析

为研究黑斑蛙重盘吸虫在同盘总科的系统发育地位，从NCBI下载同盘总科吸虫以及与其亲缘关系较近的棘口总科Echinostomatoidea吸虫：(KF475773)、(NC023095)、(KP341657)、(KM397348)、(KM400624)、(MH393928)、(MN116706)、(KR062182)、(AF216697)和(MH621335)，并选取(AF215860)为外群，构建系统发育树。采用PhyloSuite(Zhang.，2020)完成对12个蛋白编码基因的提取、比对、修剪、串联、数据分区、模型选择和构建贝叶斯(BI)系统发育树，之后导入iTOL(Letunic & Bork，2021)编辑和美化。

2 结果

2.1 形态学

虫体前端狭小，中部膨大，后端圆钝，呈纺锤形。口吸盘较小，其后有1对口支囊。食道存在。腹吸盘位于体末端，中央盘状突起存在。食管球明显。两肠支长而宽大，具有5～10个弯曲，延伸至腹吸盘的前缘。睾丸光滑，位于虫体中段。阴茎囊呈带状。生殖孔位于肠分叉之后。卵巢位于睾丸后，偏右侧，类圆形。子宫环分布于两肠之间，含少数虫卵。卵黄腺呈滤泡团块状，在肠支内外侧或与其重叠。排泄囊位于腹吸盘背侧，开孔于腹吸盘水平的前缘。根据上述形态特征确定所采集样本为黑斑蛙重盘吸虫。

2.2 线粒体基因组特征和核苷酸的使用

黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组序列全长 14 697 bp(GenBank登录号：MW698822)，由22个tRNA基因、12个蛋白编码基因(～、、～、、)、2个rRNA基因和1个非编码区组成。各基因间有1～33 bp的基因间隔序列或无基因间隔序列的情况下彼此相邻或重叠1～41 bp(图1；表1)。基因组序列A、T、G、C含量分别为19.3%、40.7%、28.5%、11.5%，其中，蛋白编码基因的AT含量为59.7%，与线粒体全基因组的AT含量(60.0%)接近；基因的AT含量最高(65.2%)；基因的AT含量最低(57.1%)。

表1 黑斑蛙重盘吸虫Diplodiscus nigromaculati线粒体基因注释Table 1 Gene annotation of the mitochondrial genomes of Diplodiscus nigromaculati

图1 黑斑蛙重盘吸虫Diplodiscus nigromaculati线粒体基因组结构Fig. 1 Mitochondrial genome structure of Diplodiscus nigromaculati

2.3 蛋白编码基因和密码子的使用

黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组序列的蛋白编码基因总长10 107 bp，包含了3 357个氨基酸。每个蛋白编码基因和密码子(123位)都呈现了较高的AT偏倚性。蛋白编码基因有2种起始密码子：ATG和GTG，2种终止密码子：TAA和TAG，且大多数蛋白编码基因的起始密码子为ATG。

在蛋白编码基因中最多使用的氨基酸是亮氨酸(Leu1：3.04%和Leu2：13.52%)、缬氨酸(Val：13.82%)和丝氨酸(Ser1：5.42%和Ser2：5.27%)(图2)。在蛋白编码基因的密码子家族中使用最多的密码子是UUG(319)和UUU(310)，最少的是ACC(4)和CUC(5)。

图2 黑斑蛙重盘吸虫Diplodiscus nigromaculati线粒体基因组蛋白编码基因同义密码子相对使用度Fig. 2 Relative synonymous codon usage of Diplodiscus nigromaculati mitogenome

2.4 tRNA与rRNA

黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组全序列共发现 22个tRNA基因，长度为57～72 bp；除基因和基因外，其他基因都呈传统的三叶草结构；基因缺失DHU臂；基因缺失TΨC臂，这一结构特征在已发表的复殖吸虫线粒体基因组 tRNA结构中未见。除基因和基因外，其他基因的反密码子起始都是T或G。

基因(16S)和基因(12S)分别长 1 057 bp 和730 bp，位于基因和基因之间，仅通过1个基因分隔开。这一排列特征与已报道复殖吸虫线粒体基因组一致。

2.5 非编码区

黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组的非编码区位于基因和基因之间，长1 042 bp，其余为1～33 bp较短的基因间隔序列。非编码区的AT含量为64.2%，与编码区的AT含量相近。在非编码区中通过人工比对，发现了2条重复序列，每条为112 bp，分别位于13 945～14 056和14 305～14 416；因其未相邻，所以未被Tandem Repeat Finder(Gary，1999)和mreps(Kolpakov.，2003)检测到。

2.6 系统发育分析

系统发育树所有分支节点具有较高置信度(贝叶斯后验概率大部分为1)。系统发育树包括2个大分支：一支由同盘总科的5个物种组成(包括重盘科、腹袋科Gastrothylacidae和同盘科Paramphistomidae)，另一支由片形科Fasciolidae的2个物种和棘口科Echinostomatidae的3个物种组成(图3)。在同盘总科中，黑斑蛙重盘吸虫与其他物种关系较远。

图3 基于贝叶斯法的11种复殖吸虫线粒体12个蛋白编码基因序列构建的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of concatenated 12 protein coding genes of mitochondrial genomes from 11 species of Digenea based on Bayesian inference

3 讨论

复殖吸虫的宿主特异性较弱，生活史中可选择不同属，甚至不同科的物种作为终末宿主(吴宝华，1991；唐崇惕，唐仲璋，2015)。研究者曾在黑斑蛙和泽蛙的消化道中发现自然感染的黑斑蛙重盘吸虫(高利宾，2007；周庆安，2013)，本研究中的黑斑蛙重盘吸虫于滇蛙消化道内发现，滇蛙为其宿主新记录。

基因重排和互换是线粒体基因组的一个重要特征(张东，2020)。黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组除基因和基因发生互换外，其他基因排列与大多数复殖吸虫一致。从已报道的、(Yan.，2013)、(Yang.，2016)和(Han.，2020)4种同盘总科吸虫的线粒体基因组结果看，和基因互换似乎是同盘总科吸虫的一个重要遗传学特征。Littlewood等(2006)推测线粒体基因组中tRNA基因互换可能隐含了系统发育的相关信息(Littlewood.，2006)。本研究中黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组中和基因的互换现象为后续开展该类吸虫系统发育研究提供了明确的靶标。

碱基偏倚最能体现序列进化的特征，其可能来自自然突变或选择压力等其他因素(钟东等，2002)。本研究中黑斑蛙重盘吸虫的蛋白编码基因AT碱基占比为59.7%，比其他同盘总科吸虫低。因此，我们认为重盘属吸虫可能是一类GC→AT突变压力相对较小的类群。富含GC碱基密码子的基因通常指向了高度表达的基因(Lamolle.，2019)，扁形动物绦虫的相关研究也证实了这一推论(Chen.，2013；Yang.，2014，2015；Huang.，2017；Maldonado.，2018)。自然选择是基因高度表达的结果，密码子偏倚是碱基突变偏倚和自然选择之间平衡的结果(Sharp & Zeng，2010；Plotkin & Kudla，2011)。综上所述，本研究推测黑斑蛙重盘吸虫的这种密码子偏倚可能与重盘科吸虫的生态多样性和生理多样性有关。

基于线粒体基因组的系统发育分析结果更可靠(Waeschenbach.，2012)。复殖吸虫的物种多样性较高，加之形态结构特征的差异往往比较细微，仅依靠形态学手段往往存在“主观误差”：重盘属吸虫的形态特征与同盘科吸虫十分相似，唐崇惕和唐仲璋(2015)将其纳入同盘科。线粒体基因组的系统发育关系显示，黑斑蛙重盘吸虫单独为一支，腹袋科和同盘科的关系与黑斑蛙重盘吸虫更近。该结果支持Jones等(2005)的分类系统，认同重盘属隶属于重盘科。

目前仅有85种复殖吸虫(将其中未定种假定为不同的种)完成线粒体全基因组测序。该类吸虫记录物种超过18 000种(Bray.，2008)，仍有极大部分复殖吸虫线粒体基因组信息未被研究和报道。而同盘总科的复殖吸虫是一类不容忽视的可导致动物吸虫病的寄生虫(Horak，1971；Yan.，2013)，影响畜牧业的发展(Anuracpreeda.，2012；王根红，张志忠，2018)。从遗传学和基因组学的角度进一步揭示这类复殖吸虫对宿主的选择及致病机制，将有力推动吸虫病的防控。本研究首次揭示了黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组序列及其特征，为后续开展基于线粒体基因组信息的重盘科吸虫的分子系统发育和流行病学研究提供重要参考。

感谢云南师范大学生命科学学院的敬凯老师在蛙类标本采集与鉴定中给予的帮助。