基于网络药理学的六味地黄汤治疗糖尿病的机制研究*

张艳军，刘晓琴

（1.晋城市中医医院，山西 晋城 048000；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619）

糖尿病是因糖代谢异常及胰岛素缺乏而引起人体组织功能发生障碍的一种代谢性疾病，常伴有许多的并发症，以高血糖为主要标志[1]。长期存在的高血糖会导致眼、肾脏、心脏、血管等的慢性损害、功能障碍[2]。据最新报道，目前全球成人糖尿病患病率为9.3%[3]；据估计，到2045年成人糖尿病患病率将达9.9%[4]。据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）报道，到2030年将会有5.78亿成人患糖尿病[5]。糖尿病已成为当前威胁人类生命健康的非传染性疾病之一，然而，糖尿病的发病机制尚未被完全阐明。现代医学治疗糖尿病需要长期服用药物，而降糖药物有许多不良反应及副作用，且很难根治。

中医学认为糖尿病属“消渴”范畴，且认为其发生与阴虚燥热有紧密关系，糖尿病治法在于补肾养阴。阴虚型消渴的代表方药是六味地黄汤，其具有安全性高、毒副作用小、治疗效果较理想等优势[6]。六味地黄汤处方中包括熟地黄、牡丹皮、山茱萸、泽泻、山药、茯苓6味中药，其中熟地黄是君药，具有补髓滋阴补肾的功效；山茱萸具有补益肝肾的功效；山药具有降血糖、补肾、健脾等功效；牡丹皮、泽泻、茯苓三味药具有清热、凉血、利水等功效[7]。有研究[8]表明六味地黄汤可以改善2型糖尿病模型大鼠的胰岛素抵抗，可以改善糖尿病发病过程中存在的葡萄糖代谢异常情况、调节血脂[9]，可用于糖尿病、肾炎、神经衰弱等患者的治疗，广泛应用于临床，且有良好的治疗效果[10]。

随着现代分子生物学、蛋白质组学、基因组学等学科的发展，药物对疾病治疗的研究已进入到了细胞和基因水平。目前对六味地黄汤治疗糖尿病及其并发症的临床研究报道较多，但对其活性成分、药理作用及治疗机制的研究报道较少；传统的理论因缺少化学及生物学的表征，难以和现代科学融合[11]。因此，本研究着重探讨六味地黄汤治疗糖尿病的机制，找出其活性成分，并研究其药理作用及机制。

1 材料

1.1 网络药理学研究工具 数据库和软件：基因表达数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/）；京都基因和基因组百科全书（KEGG，https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）；Strawberry Perl 5.30.2（Perl，http://Strawberryperl.com/）；R语言3.6.3（Lucent Technologies，http://www.r-project.org）；Cytoscape 3.7.2（The Cytoscape Consoritum，http://cytoscape.org）。

1.2 实验动物 7周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，体质量18～22 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物房温度（23±2）℃，相对湿度（50±10）%，12 h光照/12 h黑暗循环，自由摄食饮水，所用小鼠实验前均适应性饲养1周。本研究动物处置符合“3R”原则。伦理批准编号：JCPH.No20220713001。

1.3 药物与试剂 六味地黄汤，方药组成：熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g，泽泻9 g。以上中药材均购自山西和仁堂中药饮片有限责任公司，且经杜晨晖教授鉴定为正品。上述药材煎煮两次，浓缩为含生药1 g/mL的药液，于4 ℃保存备用。高脂饲料购自小黍有泰（北京）生物科技有限公司；链脲佐菌素（STZ）（批号：WXBD4971V）购自美国Sigma公司；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗体（批号：CN89330）、p-PI3K抗体（批号：CN89330）、蛋白激酶B（Akt）抗体（批号：AA44161）、p-Akt抗体（批号：AA44161）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号：AA64132）均购自Bioworld公司；HRP-羊抗兔IgG（批号：BST16G15B16H55）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：16F02A12）、广谱磷酸酶抑制剂混合物（×100）（批号：16L21C83）、增强型RIPA裂解液（批号：16D16B02）均购自博士德生物工程有限公司；Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）（批号：20210311）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 主要仪器 TGL-20B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Image J软件（美国国立卫生研究院）；GeneGnome成像系统（基因有限公司）。

2 方法

2.1 网络药理学研究

2.1.1 糖尿病差异（关键）基因的获取 利用GEO数据库查找、下载有关糖尿病的矩阵文件和平台文件[12]，获得正常组样品22个（GSM610904～GSM610925）和实验组样品18个（GSM6 10886～GSM610903），利用Perl对其进行整理；使用软件R对所得样本进行筛选，绘制糖尿病GEO数据库差异热图和火山图。

2.1.2 六味地黄汤中药有效成分的获取 利用TCMSP数据库查找熟地黄、山药、茯苓、牡丹皮、山萸肉、泽泻的有效成分，筛选条件为生物口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18[13]。

2.1.3 六味地黄汤候选靶标的获取 在TCMSP数据库下载六味地黄汤中6味中药的药物靶点并进行整理，再用Strawberry Perl 5.30.2软件进行药物靶点ID转换。

2.1.4 中药复方调控网络的构建 Strawberry Perl 5.30.2软件处理药物靶点ID转换后的表格和差异基因表格，得到network.txt和node.txt两个准备文件，Cytoscape3.7.2软件构建六味地黄汤与糖尿病的“有效成分-靶点-疾病”中药复方调控网络。

2.1.5 蛋白互作网络和网络拓扑分析的构建 PPI网络来源于以下几个数据库：DTP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND数据库。运用Cytoscape3.7.2对中药复方调控网络里的所有基因进行PPI蛋白互作网络制作，构建之前定义相关参数。PPI蛋白互作网络是一个庞大的网络，直接观察看不出里面的基因或者蛋白，需要进行网络拓扑分析。再运用Cytoscape 3.7.2中的CytoNCA包进行网络拓扑分析，以节点度值（Degree Centrality，DC）＞61、介数中心度（Betweenness Centrality，BC）＞100为筛选标准，创建子网络后，最终得到核心网络。

2.1.6 GO富集分析、KEGG富集分析 通过R语言，选择生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）3个模块对六味地黄汤中的靶点和糖尿病基因进行GO富集分析、KEGG富集分析；利用Perl语言将六味地黄汤干预糖尿病的关键靶标名称转换为Entrez ID后，以P＜0.05为筛选条件，运用Cytoscape构建KEGG关系网络，并将信号通路富集结果可视化。

2.2 动物实验

2.2.1 造模与分组 适应性饲养1周后，将小鼠按随机数字表法分为正常组8只和造模组32只。正常组小鼠喂食普通饲料，造模组小鼠喂食高脂饲料。饲养10周后，禁食过夜，造模组小鼠按100 mg/kg剂量腹腔注射STZ造模，正常组小鼠腹腔注射同等剂量的柠檬酸缓冲液，1次/d，连续3 d。注射后测空腹血糖值，以血糖值≥11.1 mmol/L为造模成功条件。将32只造模成功小鼠按随机数字表法分为模型组、六味地黄汤低剂量组、六味地黄汤高剂量组、二甲双胍组，每组8只。

2.2.2 实验给药 六味地黄汤低、高剂量组小鼠分别灌胃给予六味地黄汤，7.5、15 g/kg；二甲双胍组小鼠灌胃给予二甲双胍溶液，250 mg/kg；模型组与正常组小鼠灌胃给予等体积纯净水，1次/d，连续4周。末次给药后12 h，10%水合氯醛麻醉小鼠，取肾脏，备用。

2.2.3 Western blotting 法检测小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白的表达水平 取小鼠肾脏，使用T-PER组织蛋白提取试剂提取蛋白，Bradford法测定蛋白含量，SDS-PAGE法分离30 μg蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上，于5%脱脂奶粉中孵育30 min，室温封闭1 h后，与抗体p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、β-actin（1∶500）在4 ℃孵化过夜；TBST洗膜后，与HRP标记兔二抗（1∶2 000）室温孵育1.5 h。GeneGnome成像系统曝光，Image J软件分析，所得灰度值即为蛋白相对表达量。

2.3 统计学方法 运用Graphpad Prism 6.0统计软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，各组实验数据经方差齐性检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 糖尿病差异（关键）基因 以lgFC≥1、P＜0.05为条件对糖尿病矩阵文件和平台文件进行处理得到糖尿病的差异基因2 255个，其中上调基因1 004个，下调基因1 251个；绘制糖尿病GEO数据库差异热图（见图1A）和GEO数据库差异火山图（见图1B）[14]。热图中横坐标为组别（C.正常组；T.实验组），纵坐标为基因名称，其中，红色、黑色和绿色分别代表高表达、中表达和低表达。火山图中，lgFC＜0为绿色，表示在实验组为下调基因；lgFC=0为黑色，表示正常组与实验组无差异基因；lgFC＞0为红色，表示在实验组为上调基因；颜色越亮表示基因表达越显著。差异基因RPS4Y2和RPS4Y1在正常组高表达，在实验组低表达；差异基因XIST在实验组高表达，在正常组低表达。（见图1）

图1 糖尿病GEO 数据库差异热图（A）与火山图（B）

3.2 六味地黄汤中主要有效成分 在TCMSP数据库中共找到有效成分74个，其中，熟地黄2个、山茱萸20个、山药16个、牡丹皮11个、茯苓15个、泽泻10个[15]。（见表1）

表1 六味地黄汤各种中药有效成分

3.3 六味地黄汤靶标 从TCMSP数据库搜索处方中各个中药的药物靶点，并进行中药复方靶点整理后，得到584个有效成分和靶点，其中熟地黄34个、山茱萸130个、山药144个、茯苓30个、泽泻9个、牡丹皮237个。进行药物靶点ID转换，得到506个有用结果，即熟地黄30个、山茱萸108个、山药122个、茯苓23个、泽泻9个、牡丹皮214个。

3.4 中药复方调控网络 中药复方调控网络共有24个有效成分，30个基因，其中来源于山药的有效成分最多（9个）；网络图共有53个节点，其中药物分子24个、靶点基因29个，共有82条连线；药物分子中槲皮素（Degree=23）、山奈酚（Degree=12）、β-谷甾醇（Degree=5）度值较大，作用的靶点较多，说明其在治疗糖尿病的治疗过程中发挥主要作用。（见图2、表2～3）

图2 中药复方调控网络

表2 六味地黄汤有效成分药物分子及其度值

表3 六味地黄汤治疗糖尿病相关靶点基因及其度值

3.5 PPI 蛋白相互作网络和网络拓扑分析 利用度值（Degree Centralities，DC）分析之后得到1 402个凝接节点（见图3A），以DC（406-61）进行过滤得到170个节点（见图3B），创建子网络，再进行介度中心数（Betweenness Centralities，BC）分析，以BC（840-150）进行再次过滤处理，创建一个新的子网络后，最终核心网络存在43个节点。（见图3C）

图3 六味地黄汤治疗糖尿病相关靶点的PPI 网络（A）与拓扑网络（B、C）

3.6 GO富集分析 研究六味地黄汤对糖尿病的治疗作用，以P＜0.05为过滤条件，对药物和疾病的靶点基因采取GO富集分析，得到结果有282个条目，包括生物学过程相关条目243个、细胞组分相关条目20个、分子功能相关条目19个。GO富集分析生物学过程相关条目主要有上皮细胞增殖（epithelial cell proliferation）、调控上皮细胞增殖（regulation of epithelial cell proliferation）、类固醇激素反应（response to steroid hormone）等；细胞组分相关条目主要有顶端等离子体膜（apical plasma membrane）、细胞的顶端部分（apical part of cell）、横向等离子体膜（lateral plasma membrane）等；分子功能相关条目主要有蛋白激酶调节活性（protein kinase regulator activity）、激酶调节活性（kinase regulator activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）等。筛选出P＜0.05生物学过程的前20个条目、细胞组分的20个条目、分子功能的19个条目制作GO富集分析柱状图。（见图4）

图4 六味地黄汤相关靶点的GO 富集分析图

3.7 KEGG富集分析 KEGG富集分析得到37条通路，筛选前20条作出气泡图（见图5A）；KEGG关系网络中共有20条通路、17个基因；结果表明基因显著富集在神经活性配体受体相互作用信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ca2+信号通路和AMPK信号通路等通路上（见图5B）。

图5 KEGG 富集分析气泡图（A）与KEGG 关系网络（B）

3.8 各组小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量比较 与正常组比较，模型组小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，六味地黄汤高剂量组、二甲双胍组小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达水平均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），六味地黄汤低剂量组小鼠肾脏中p-Akt/Akt表达水平明显升高（P＜0.05）。（见图6～7）

图6 各组小鼠肾脏中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表达Western blotting 图

图7 各组小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量比较 （±s，n=8）

4 讨论

本研究通过对六味地黄汤治疗糖尿病的靶点进行PPI蛋白互作网络和网络拓扑结构分析，得到六味地黄汤治疗糖尿病的关键靶点，包括雌激素受体α基因（ESR1）、雄激素受体（AR）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、内表皮生长因子（EGF）、β2肾上腺素受体（ADRB2）、蛋白激酶B（AKT1）等；通过GO富集分析得到六味地黄汤治疗糖尿病关键靶点的相关功能，主要包括上皮细胞增殖、调控上皮细胞增殖、类固醇激素反应、蛋白激酶调节活性、激酶调节活性等方面；通过KEGG富集分析得到六味地黄汤治疗糖尿病的基因显著富集在神经活性配体受体相互作用信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ca2+信号通路和AMPK信号通路等通路上，初步探讨了六味地黄汤治疗糖尿病的药效物质基础和治疗机制；通过小鼠体内实验，采用六味地黄汤对糖尿病模型小鼠进行治疗，对网络药理学所得结果进行验证，结果表明，六味地黄汤可升高小鼠肾脏中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表达水平，为其进一步研究应用提供参考和方向。

2型糖尿病患者会伴随严重的脂代谢异常，雌激素和ESR1结合之后可调节脂质代谢，现代医学对绝经后妇女糖尿病人群进行雌激素替代治疗，发现其糖耐量升高、胰岛素抵抗降低[16-17]。据报道，肿瘤抑制因子P53（TP53）与肥胖症有关[18]。ADRB2可以特异性地与内源性配体结合并被激活，产生生物学效应，在脂质代谢和能量消耗中发挥重要作用[19]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于PI3K/AKT信号通路的核心部位，在调节胰岛素细胞的刺激反应、增进细胞的生存能力和生长发育中发挥着不可替代的作用[20]；研究表明AKT1可在能量代谢通路中发挥作用[21]。胰岛素是机体内唯一可降低血糖的激素，同时能促进糖原、脂肪、蛋白质合成；PI3KAkt作为胰岛素信号转导的主要通路，具有调节控制机体中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用[22]；增强PI3K/Akt信号通路的表达可减轻胰岛素抵抗[23]。

六味地黄汤中起主要治疗效果的中药是山茱萸和山药，而六味地黄汤的君药是熟地黄，二者结论不统一，出现这种情况的具体原因有待进一步探究。目前网络药理学在中药复方中的应用处在初期阶段，只是对药物治疗疾病的靶点进行预测，具体的治疗效果需要在临床应用中方可得到体现。这进一步说明网络药理学在中医药中的应用有很大的发展空间。

六味地黄汤治疗糖尿病的作用机制可能与调节PI3K-Akt信号通路有关，可为其进一步研究应用提供参考，但更深层次的原理还需继续探索。