节律基因NPAS2在肿瘤中的研究进展

陈雅凡 王刚 田艺苑 同红伟，4 袁鹏

作者单位：710068 西安 1西安体育学院研究生部；710068 西安 2西安体育学院运动与健康科学学院；716000 延安 3延安大学医学院；716099 延安 4延安市人民医院；710038 西安 5空军军医大学第二附属医院核医学科

生物节律是生物体在适应地球自转和公转所表现出与环境相适应的一系列的周期性变化，是生物体在漫长的生物进化过程中形成的一种内源性节律。在哺乳动物中，生物节律主要是由一系列核心生物钟基因转录和翻译后形成负反馈环路调控，进而产生诸如激素分泌、体温波动等昼夜节律。哺乳动物的昼夜节律系统包括位于大脑的中央振荡器，以及除大脑外身体几乎所有的组织器官中的外周振荡器。中央振荡器又叫中枢时钟，位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的神经元，SCN接收来自视网膜的光信息，中枢时钟通过神经和体液途径使外周时钟与外部光/暗周期同步［1］。目前，已有9种在哺乳动物下丘脑视交叉上核和外周组织中表达的核心昼夜节律基因被广泛研究，包括神经元PAS结构域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1）、昼夜节律运动输出周期故障（circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）、CRY1/2、PER1/2/3、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS［2］，其中NPAS2是哺乳动物分子量最大的核心节律基因，参与生物钟的调控。NPAS2还可以通过调控细胞周期、细胞增殖和凋亡相关基因，参与肿瘤发生、肿瘤细胞生长和转移等多个细胞活动过程。本文就NPAS2在肿瘤中作用的研究进展作一综述。

1 NPAS2概述

1.1 NPAS2的结构

NPAS2最早于1996年由ZHOU等在研究小鼠大脑早期发育时被发现，是目前检测到的最大核心生物钟基因（176.68 kb），定位于人染色体2p11.2-2q13上［3］，含有37个外显子，转录后产生23个不同的mRNAs，16个可变剪切异构体，12个可变启动子。NPAS2蛋白属于bHLH-PAS转录因子家族。N端包括9～59位氨基酸组成的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）结构域、82～152位氨基酸组成的PAS-A结构域、237～307位氨基酸组成的PAS-B结构域以及311～354位氨基酸组成的PAC结构域。bHLH结构域能介导蛋白质之间的相互作用，促进二聚体的形成，PAS-A和PAS-B结构域大约有260个氨基酸的长度，含有2个约含60个氨基酸的同向重复，可介导与DNA结合，PAC结构域伴随PAS结构域出现，有助于PAS结构域的折叠。NPAS2的C端则是核受体连接区，可调节与NPAS2有关的核受体结合［4］，见图1。

图1 NPAS2蛋白的基本结构Fig.1 Basic structure of NPAS2 protein

1.2 NPAS2的表达与调节

NPAS2在人体分布广泛，不仅在中枢神经系统表达，还在除睾丸组织外的几乎所有外周组织中分布，其中在中枢神经系统中主要分布于SCN［5］。NPAS2与另一核心节律基因CLOCK为同源基因，都具有bHLH/PAS结构域和核受体相互作用域［6］。有研究报道在外周组织和视交叉神经核中NPAS2功能上可以替代CLOCK调节昼夜节律［7］，两者都能与BMAL1结合形成异源二聚体。NPAS2因可结合亚铁血红素而对CO敏感，而CO主要通过与PAS-A结合域结合，阻碍bHLH-PAS结构域与DNA结合［8］。NPAS2本身对E-box序列没有亲和力，不能单独与DNA结合，只有与BMAL1形成的异源二聚体才能与DNA的E-box结合［9］。因此，CO浓度高时会影响NPAS2/BMAL1的转录调控功能，当CO浓度较低时，其转录功能恢复。

随着地球自转，哺乳动物的生物节律会通过节律基因转录、翻译而形成的负反馈环路不断进行周期性调节和振荡［10］，其中负反馈环路包括正向环路和反向环路。核心的节律基因包括BMAL1、CLOCK、CRY1/2、PER1/2/3、NPAS2、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS，其中正向环路又包括NPAS2、CLOCK和BMAL1。NPAS2（或CLOCK）与BMAL1结合形成异源二聚体，并在下游节律因子如周期蛋白（period，PER）家族和隐花色素（cryptochrome，CRY）家族启动子的E-box上激活其转录，从而促进CRY和PER蛋白在细胞质积累［11］。当CRY和PER积累到一定程度，PER会被酪氨酸激酶磷酸化，与CRY形成异源二聚体后入核，随着PER与CRY入核增多，PER/CRY异源二聚体会抑制NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1复合体的转录激活作用，进而形成负向环路［12］。但随着PER/CRY复合物的降解，其对NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1复合体的抑制作用逐渐减弱，复合体将恢复与靶基因E-box结合，再次激发转录，正反环路循环往复，从而形成昼夜节律的负反馈环路［13］，见图2。

图2 昼夜节律反馈环路Fig.2 Circadian rhythm feedback loops

2 NPAS2在肿瘤中的作用

NPAS2主要作为生物钟基因参与正常昼夜节律的调节，当NPAS2出现异常，可能会出现与节律相关的疾病，如癌症、心血管疾病和代谢综合征等［14-15］。研究发现生物钟基因突变后，转基因小鼠更易发展成恶性肿瘤和导致幼稚细胞老化［16］。生物的昼夜节律失调是肿瘤发生和发展的内在因素之一，尤其是在激素依赖性肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌等肿瘤中发挥重要作用［17］，由此可见昼夜节律的改变可影响肿瘤的易感性。目前研究显示，NPAS2主要通过调控细胞周期、增殖和代谢参与肿瘤细胞生长和转移等多个细胞活动过程，并在各类型肿瘤中得到验证［18-19］。

2.1 乳腺癌

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，约占癌症患者总数的36%［20］。根据其临床特征和病理特性，常分为雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、人表皮生长因子受体2（human epithelial growth factor receptor，HER2）阳性和三阴性乳腺癌［21］。乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤，褪黑素和雌激素在乳腺癌发病机制中起重要作用。在ER阳性的乳腺癌患者中，褪黑素的抑癌作用主要是通过抑制褪黑素受体1的ER mRNA表达和ER转录活性来实现，褪黑素不仅可以调节核受体的反式激活和雌激素代谢酶及相关基因的表达，还可以抑制肿瘤细胞的糖酵解和与细胞增殖、生存、转移有关的关键细胞信号通路［22］。褪黑素通常在夜间分泌，有明显的昼夜节律性，昼夜颠倒会导致褪黑素信号被破坏，从而促进人类乳腺癌的生长［23］。而随着现代生活方式的改变，白昼环境中的非自然光和夜间人工照明的周期越来越长，破坏了昼夜节律的内源性稳定，导致肿瘤发展并加速其进展［24］。乳腺癌流行病学研究显示，倒班工作会增加患乳腺癌的风险［25］。NPAS2蛋白大部分位于细胞浆内，也有部分位于细胞核，在正常乳腺组织、乳腺癌前病变和浸润癌中均有表达。与正常组织相比，NPAS2蛋白在原位癌和浸润癌中表达下调。在不同分期浸润癌中，与Ⅰ期比较，Ⅱ期、Ⅲ期乳腺癌中NPAS2表达明显减弱，提示NPAS2的功能减弱是乳腺癌发生的重要因素，且与乳腺癌分期有关［23］。同时也有研究发现，过表达NPAS2会使大量的乳腺癌细胞停滞在G0/G1期而不能向S期转化，这可能是NPAS2抑制了ERα的转录活性，随之下调了细胞周期和增殖相关蛋白表达，最终抑制了乳腺癌细胞的增殖［26］。综上所述，乳腺癌发生与生物钟基因表达异常、突变和多态性有关，且在乳腺癌中NPAS2可能作为抑癌基因发挥作用，未来进一步探索节律基因和乳腺癌的关系，可能对乳腺癌的治疗策略和路径具有借鉴意义。

2.2 前列腺癌

前列腺癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在男性恶性肿瘤中居第二位，死亡率居第五位［27］。前列腺癌具有高度异质性，不仅表现在不同患者之间肿瘤组织学的特征差异，还表现在同一患者不同肿瘤细胞在生长、侵袭、转移速度上的差异［28］。目前已有研究表明，节律基因与前列腺癌的发生、发展密切相关。一项病例对照试验探索了9种昼夜节律基因与前列腺癌风险之间的联系，结果显示前列腺癌与NPAS2和PER1表达有关［29］。另有文献报道PER1在前列腺癌细胞中过表达可抑制细胞生长和促进细胞凋亡［30］、PER3在肿瘤微环境中可通过WNT/β-catenin信号通路负向调节前列腺癌干细胞［31］。此外，与在完全黑暗的环境中睡觉相比，在强度较高的光照环境中睡觉会增加罹患前列腺癌的风险［32］，但褪黑素能使前列腺癌细胞中失调的昼夜节律重新同步化［33］。一项纳入1 511名男性工人的基因分型数据研究，评估了前列腺癌和昼夜节律基因变异和夜间工作指标之间的相互作用，结果显示昼夜节律通路与夜间工作者中侵袭性前列腺癌的发生显著相关，尤其是长时间夜班的男性，且其侵袭性前列腺癌与NPAS2和BMAL1均有关联［34］。YU等［35］发现NPAS2 rs6542993与局部和晚期前列腺癌病例的疾病进展风险明显升高有关。综上所述，目前有关NPAS2与前列腺癌关系的研究主要聚焦于患病风险，关于NPAS2与前列腺癌细胞之间内在联系与具体作用机制的研究仍需进一步探索。

2.3 肝癌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，占原发性肝癌病例的75%～85%［36］。目前常用的肝癌诊断标志物的敏感度和特异性仍不理想，尤其是用于早期肝癌诊断的分子标志物［19］。既往研究显示，昼夜节律调节异常与HCC发生和发展有关［37］。YUAN等在证实了NPAS2基因的功能多态性与经导管动脉化疗栓塞治疗的HCC患者的总生存期相关后［38］，还在217例肝癌组织中发现NPAS2表达明显高于癌旁组织，且表达与患者预后相关［39］；NPAS2还可以促进细胞增殖和抑制线粒体依赖性内在凋亡促进肝癌细胞存活。该研究还进一步探究了NPAS2在HCC葡萄糖代谢过程的作用，结果显示NPAS2在低氧诱导因子-1α介导下上调了糖酵解基因，下调了过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α的表达，从而在HCC生长和转移中起关键作用［40］。此外，肝脏疾病发展到肝癌会经历肝纤维化的过程，有研究证明，肝纤维化损伤后，NPAS2在肝星状细胞中上调，随后直接转录激活发状分裂相关增强子1，从而促进纤维化［41］。上述研究不仅表明了NPAS2在HCC中扮演着“促癌”的角色，同时也展现了NPAS2成为HCC标志物和治疗靶点的潜力。然而，HCC的发生、发展是一个复杂的过程，NPAS2是否与其他类型肝癌的发生和进展有关，例如是否参与非酒精性脂肪性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎相关肝癌的发生，及其可能的分子机制仍需进一步探索。

2.4 非霍奇金淋巴瘤

昼夜节律基因有可能影响多种癌症相关的生物学途径，昼夜节律紊乱导致的免疫失调，是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）的风险因素，同时也可能影响NHL的易感性［42］。ZHU等［43］报道NPAS2多态性与NHL发生风险降低有密切联系，研究不仅表明了昼夜节律生物标志物可能与NHL预后相关，还检测到昼夜节律基因NPAS2与NHL可能存在因果关系，该结果提供了首个分子流行病学上昼夜节律基因对淋巴瘤发生作用的证据支持。综上提示NPAS2可能成为一个新颖的NHL生物标志物，但鉴于NHL的发病率不断增加，其病因并不十分明确，NPAS2与NHL的患病风险和预后，有待进一步研究。

2.5 子宫内膜癌

子宫内膜癌根据组织学可分为子宫内膜型和非子宫内膜异型，其中子宫内膜型是雌激素依赖型，约占子宫内膜病例的80%，通常预后较好，而非子宫内膜异型（如浆液型和透明细胞型）由于对雌激素反应不强，往往预后不良［44］。ZHENG等［45］研究发现，在子宫体子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）组织中NPAS2表达上调，且NPAS2高表达会降低UCEC患者的总体生存率、无病生存率和无复发生存率；NPAS2表达还与UCEC的临床分期、肿瘤分级、ER状态和子宫肌层浸润水平呈显著正相关；NPAS2在UCEC中不仅可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和集落形成，还可以通过增强肿瘤免疫细胞浸润发挥致癌作用。因此认为，NPAS2可能是UCEC中的癌基因，有望成为子宫内膜癌的预后标志物。

2.6 急性髓系白血病

白血病是循环系统的恶性肿瘤，特征为造血细胞或最终分化的白细胞不受控制的过度生长，其中急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是成年人中最常见的急性白血病，其侵袭性和异质性强，患者总体生存率和无复发生存率极低［46］，因此寻找AML新的分子标志物和治疗靶点尤为重要。牟佼等［47］通过对46例AML患者骨髓单个核细胞的NPAS2水平进行分析，结果发现NPAS2在AML患者中表达上调且与不良预后相关，而干扰AML细胞系中的NPAS2表达可抑制细胞生长。SONG等［48］研究显示，NPAS2在AML细胞中高表达，敲低NPAS2可明显抑制AML细胞增殖并促进细胞凋亡；机制研究发现NPAS2可能通过CDC25A调控Caspase-3和bcl2/bax的表达，从而诱导细胞周期改变。以上研究表明，NPAS2可能是AML细胞恶性生长的关键调控因子，但在其他类型白血病中是否发挥同样作用还需进一步探究。

2.7 其他肿瘤

除了上述癌种，NPAS2还与其他癌种有关。MADDEN等［49］使用癌症基因组图谱数据集分析与神经胶质瘤风险和预后相关的核心生物钟基因，发现NPAS2的表达升高与患者的不良预后有关。YANG等［50］发现NPAS2在结直肠癌中表达下调，且NPAS2高表达患者的5年生存率明显高于NPAS2低表达患者，表明NPAS2在结直肠癌患者预后中具有预测价值。在结直肠癌细胞系DLD-1中，NPAS2具有抑制细胞增殖、侵袭和细胞划痕愈合能力［51］。另有研究发现，NPAS2 rs895520的次要等位基因与33%肉瘤和44%平滑肌肉瘤易感性增加相关［52］。此外，在肾癌患者中，NPAS2低表达的患者预后良好［53］。而在未分化甲状腺癌中，NPAS2明显上调，可促进肿瘤的恶性进展［54］。综上所述，NPAS2在各类型肿瘤中发挥作用不同，但是在单一癌种中的研究不够全面，仍需进一步研究。

3 小结

核心节律基因NPAS2虽然早已被发现，但是其功能尤其是在癌症发生和进展中的功能研究还有限。目前研究显示，昼夜节律的紊乱与肿瘤的发生、发展关系密切，核心节律基因NPAS2具有明显的组织特异性，在人体不同类型肿瘤组织中表达异常，但在不同类型肿瘤的发生和发展过程中可能发挥的作用不同，可能作为抑癌基因也可能作为促癌基因发挥作用，因此具有成为肿瘤标志物和治疗靶点的潜力。但由于NPAS2参与了机体大量的生理过程，对其作用和功能的全面理解有待于进一步的研究。深入探索NPAS2与肿瘤之间的联系和内在机制，将为揭示肿瘤的发生、发展、肿瘤的预防和治疗提供新思路，同时也有助于验证其作为新的治疗靶点和标志物的可能性。