miR-29a-3p靶向KDM5B调控肾透明细胞癌增殖和侵袭

仇海军 李玉明 胡金朋

作者单位：300162 天津 武警特色医学中心1急诊医学科，2研究部

肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是肾脏恶性肿瘤主要的侵袭类型，由于早期征兆不易察觉，大多数患者确诊时已是晚期，预后较差［1-2］。晚期KIRC放疗和化疗的疗效较差，预后不良，因此手术切除仍然是目前治疗KIRC最有效的方法［3］。尽管现代医疗取得了进步，但是KIRC患者的5年生存率仍低于20%，因此亟需探索更有效的预后标志物和治疗靶点［4］。近年来，表观遗传修饰在癌症中的作用研究取得了很大进展，其中组蛋白甲基化及其修饰物的失调被认为与多种人类癌症相关［5-6］。组蛋白3赖氨酸4（histone 3 lysine 4，H3K4）去甲基化酶基因中组蛋白赖氨酸去甲基化酶［lysine（K）demethylase 5，KDM5］家族的4个成员（KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D）均包含1个 JmjC结构域，能够将 H3K4中的转录活性染色质去除［5，7］。目前，许多研究已报道了KDM5家族在癌症发生和发展中的作用，包括前列腺癌［8-9］、肺癌［10-11］和胃癌［12］等。既往研究发现，KDM5B表达水平的升高可以通过多种表观遗传效应促进肝癌细胞的生长及维持慢性髓系白血病［13-14］。miRNA常通过不完全互补方式与目标 mRNA 的 3′非翻译区（3＇-untranslated region，3′UTR）结合来负向调节靶基因的表达，而这种结合往往会影响细胞转化和肿瘤进展［15-16］。研究表明miRNA可作为肿瘤抑制因子或致癌因子而影响肿瘤的发生发展［17］。目前研究也显示，miR-29a-3p与肿瘤关系密切，可作为肿瘤抑制因子而参与调控多种肿瘤的生物学过程［18-19］。如miR-29a-3p通过调控KDM5B蛋白抑制前列腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡［20］。然而miR-29a-3p与KDM5B在KIRC中的关系尚未明确。因此，本研究旨在阐明miR-29a-3p和KDM5B在KIRC中的作用及其作用机制，以期为临床相关研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人KIRC细胞786-O、Caki-1及293T细胞购自中科院细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、胰酶和青霉素/链霉素购自Gibco公司，mRNA反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit购自Takara公司，miRNA反转录试剂盒HyperScriptⅢmiRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自新贝（上海）生物科技有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂、Opti-MEM培养基购自 Life Technologies，miR-29a-3p inhibitor、KDM5B、KDM5B WT、KDM5B MUT、miR-29a-3p mimics和mimics-NC质粒由赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成，MTS试剂、RT-qPCR引物、内参引物、Trizol及去RNA酶处理的物品购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，Tranwell小室、细胞培养板及计数板购自康宁公司。

1.2 利用TCGA数据库分析H3K4去甲基化酶在KIRC中的表达及对预后的影响

从包含TCGA数据的网站（http：//www.linkedomics.org）下载KIRC患者数据集TCGA_LIHC RNASeq和TCGA_LIHC Clinical，数据信息包括细胞变异、转录组分析、生物样本信息、原始测序数据、拷贝数、DNA甲基化、临床信息等。筛选出同时包含生存时间数据信息和H3K4去甲基化酶基因表达数据的患者。根据KIRC的分期将患者分为L-stage组（Ⅰ期和Ⅱ期，n=315）和H-stage组（Ⅲ期和Ⅳ期，n=201），分析不同分期KIRC患者H3K4去甲基化酶基因表达情况及对预后的影响。

1.3 细胞培养及转染

人KIRC细胞系786-O、Caki-1分别接种至含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，并置于37°C、5%CO2的恒温箱中培养，待细胞汇合度达80%后，收集细胞用于后续实验。

选取对数生长期的786-O和Caki-1细胞，用胰酶消化并计数后，按5×105/孔铺于6孔板，待细胞密度达90%时，根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作步骤分别转染miR-29a-3pmimics、mimics-NC和miR-29a-3p inhibitor，并分别定义为miR-29a mimic组、mimics NC组和Inhibitor组。各组细胞继续培养24 h后，收集待用。

1.4 RT-qPCR检测miR-29a-3p和KDM5B mRNA的表达水平

采用Trizol法提取细胞中的总RNA，用Qubit荧光定量仪定量总RNA后，采用反转录试剂盒Prime-Script RT reagent Kit将总 RNA（1 μg）反转录为 mRNA反应所需的cDNA，反应程序为37℃15 min，85℃5 s。采用反转录试剂盒HyperScriptⅢmiRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit将总 RNA（1 μg）反转录为miRNA反应所需的cDNA，反应程序为25℃5 min，50℃15 min，85℃5 s。RT-qPCR反应条件：95℃ 变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，重复40个循环。基因及引物序列见表1，miR-29a-3p以U6作为内参，KDM5B以β-actin 作为内参。采用 2-ΔΔCt法计算 miR-29a-3p 和KDM5B的相对表达量，结果以平均值±标准差表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p与KDM5B的靶向关系

利用生物信息学网站TargetScan预测KDM5B的保守结合序列miR-29a-3p。将与miR-29a-3p结合的KDM5B mRNA 3′UTR序列的野生型（WT）或突变型（MUT）插入pmirGLO质粒中，以构建重组荧光素酶报告质粒（KDM5B WT和KDM5B MUT）。按试剂使用说明，用Lipofectamine 2000转染试剂将miR-29a-3p mimics/mimics-NC与pmirGLO/KDM5B WT/KDM5B MUT共转染到293T细胞，继续培养48 h后，利用双荧光素酶报告基因检测法检测293T细胞的荧光素酶活性。采用萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性来表示相对荧光素酶活性。

1.6 MTS法检测786-O、Caki-1细胞的增殖能力

用DMEM完全培养基悬浮细胞，以2×104/孔置于96孔板中，每组设3个复孔。各组细胞分别孵育24 h、48 h、72 h和96 h后，向每孔加入10 μL MTS试剂，继续培养4 h，用酶标仪检测490 nm波长处各孔的光密度（OD）值，取各组OD均值绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.7 Transwell小室实验检测786-O、Caki-1细胞的侵袭能力

用0.25%胰酶消化各组转染细胞，无血清DMEM培养基调整细胞密度为1×105/mL，在预铺Matrigel基质胶的Transwell上室内加入200 μL细胞悬液，下室内加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养24 h后，取出Transwell小室，经PBS清洗后，用棉签擦去小室薄膜上层细胞，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗后吸干上层固定液，每孔加入0.1%结晶紫染色液800 μL，室温浸染下层细胞20 min，流水浸泡后，置于光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野进行计数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件处理实验数据，GraphPad Prism 5软件绘图，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验；相关性分析采用Spearman相关性分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Logrank检验，Cox回归分析用于生存差异比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分期KIRC患者H3K4去甲基化酶表达情况及其与预后关系

TCGA数据分析结果显示，与L-stage组相比，H-stage组中 KIRC患者的 KDM5B、KDM5C、FBXL10、LSD1和LSD2表达水平均明显升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05），其中表达水平差异最明显的是KDM5B，而KDM5A、KDM5D表达水平无统计学差异（P＞0.05），见图1A～G。KIRC患者中KDM5B表达量的中位数为10.11，以10.11为界值将患者分为低表达组（Low组）和高表达组（High组）。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，Low组患者术后生存率高于High组，差异有统计学意义（HR=2.882，P＜0.001），见图1H。

图1 KIRC患者H3K4去甲基化酶表达情况Fig.1 Expression of H3K4 demethylase in KIRC patients

2.2 KIRC患者中KDM5B表达水平与miRNA的相关性分析

经过生物信息学网站TargetScan预测，miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p作为保守序列作用于人源KDM5B基因，作用位点见图2A。通过TCGA数据网站下载这3个miRNA的表达数据信息。数据分析结果显示，与L-stage组KIRC患者癌组织相比，H-stage组KIRC患者癌组织的miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p表达水平均明显下降，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图2B～D；其中miR-29a-3p表达水平差异最为明显。KDM5B表达水平与miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p的表达水平均呈负相关（r=-0.283，-0.246，-0.259；均P＜0.001），见图2E～F；其中miR-29a-3p表达水平与KDM5B表达水平最相关，因此选择miR-29a-3p作进一步研究。

图2 KIRC患者KDM5B表达水平与miRNA的相关性分析Fig.2 Correlation analysis between KDM5B and miRNA in KIRC patients

2.3 miR-29a-3p靶向调控KDM5B的表达

双荧光素酶报告基因实验结果显示，相对于同时转染KDM5B WT和mimics-NC的293T细胞，同时转染KDM5B WT和miR-29a-3p mimics细胞的荧光素酶活性明显降低（P＜0.05）；而与同时转染KDM5B MUT和mimics-NC的293T细胞相比，同时转染KDM5B MUT和miR-29a-3p mimics细胞的荧光素酶活性差异没有统计学意义（P＞0.05），见图3。结果表明，miR-29a-3p靶向调控KDM5B的表达。

图3 miR-29a-3p靶向KDM5BFig.3 miR-29a-3p targeted KDM5B

2.4 miR-29a-3p对786-O、Caki-1细胞中miR-29a-3p、KDM5B mRNA表达水平的影响

RT-qPCR检测显示，人KIRC细胞786-O、Caki-1转染miR-29a-3p inhibitor后，与mimics NC组相比，Inhibitor组显示出miR-29a-3p表达水平明显下降，KDM5B mRNA表达水平明显升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；过表达miR-29a-3p后，miR-29a-3p表达水平明显高于mimics NC组和Inhibitor组，KDM5B mRNA表达水平明显低于mimics NC组和Inhibitor组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05），见图4。结果表明，过表达miR-29a-3p下调KDM5B的表达，而沉默miR-29a-3p上调KDM5B的表达。

图 4 miR-29a-3p对786-O、Caki-1细胞中miR-29a-3p、KDM5B mRNA表达水平的影响Fig.4 Effect of miR-29a-3p on the expression levels of miR-29a-3p and KDM5B mRNA in 786-O and Caki-1 cells

2.5 miR-29a-3p对786-O、Caki-1细胞增殖和侵袭能力的影响

MTS实验结果显示，作用96 h后，Inhibitor组786-O和Caki-1细胞的增殖能力明显高于mimics NC组（均P＜0.05），miR-29a mimic组细胞增殖能力明显低于mimics NC组和Inhibitor组（均P＜0.05），见图5A～B。Transwell实验结果显示，Inhibitor组786-O和Caki-1细胞穿膜细胞数明显高于mimics NC组（均P＜0.05），miR-29a mimic组穿膜细胞数明显低于mimics NC组和Inhibitor组（均P＜0.05），见图5C。结果表明，过表达miR-29a-3p后能提高786-O、Caki-1细胞增殖和侵袭能力，沉默miR-29a-3p后能降低786-O、Caki-1细胞增殖和侵袭能力。

图5 miR-29a-3p对786-O、Caki-1细胞增殖和侵袭的影响Fig.5 Effect of miR-29a-3p on proliferation and invasion of 786-O and Caki-1 cells

3 讨论

表观遗传基因组模式的改变是癌症的一个主要特征，组蛋白修饰的异常调控会导致人类癌症的发生［21］。既往研究表明，在胃癌［22］、乳腺癌［23］和肺癌［24］等多种癌症中组蛋白去甲基化酶H3K4的异常表达和突变可影响肿瘤的发生发展。KDM5A在肺癌细胞中可促进细胞增殖，诱导EMT，促进紫杉醇耐药［25］。过表达SOX17可抑制KDM5B而阻碍乳腺癌的发生和进展［26］。KDM5C与结肠癌细胞系的耐药性有关［27］。KDM5D低表达与前列腺癌患者预后不良有关［28］。以上研究表明，H3K4去甲基化酶KDM5家族可能作为多种肿瘤的预后标志物和治疗靶点，但KDM5家族在肾癌中的表达和功能的相关研究报道较少。本研究旨在探讨H3K4去甲基化酶KDM5家族基因在KIRC中的作用通过TCGA数据网站分析H3K4去甲基化酶KDM5家族基因在KIRC中的表达情况，结果发现5种KDM5家族基因（KDM5B、KDM5C、FBXL10、LSD1和LSD2）均与 KIRC 分期相关，表现出低分期KIRC患者癌组织中KDM5家族基因表达水平低于高分期KIRC患者，其中KDM5B的表达差异最明显。

有研究表明KDM5家族基因成员之一的KDM5B异常表达和功能与前列腺癌有关，其mRNA水平在前列腺癌组织中表达上调，且与肿瘤分级和患者生存期相关［29］。此外，KDM5B通过H3K4去甲基化修饰抑制CCL14的表达，导致Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而促进结直肠癌进展［30］。另外，KDM5B还通过调控microRNA-448介导的YTHDF3/ITGA6轴促进肝癌细胞增殖［31］。以上研究表明，KDM5B可能参与多种肿瘤的恶性生物学过程。本研究还分析了在不同分期KIRC患者癌组织中mRNA表达水平差异最明显的KDM5家族基因KDM5B的表达水平与KIRC预后的关系，结果发现KDM5B高表达患者的预后较差。这些结果提示KDM5B表达水平与KIRC预后相关，KDM5B可能作为KIRC研究的潜在靶点。

miRNA可以通过调控表观遗传网络参与肿瘤进展。有研究表明miR-29a-3p通过调控KDM5B参与前列腺癌细胞增殖和凋亡过程［20］。miR-29a通过调节P53/MDM2反馈回路，提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性［32］。本研究通过生物信息学网站TargetScan预测到KDM5B的保守结合位点有miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p。通过TCGA数据网站筛查以上3个miRNA在KIRC的表达情况，结果发现均与KIRC分期相关，表现出低分期KIRC患者癌组织中miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p表达水平均高于高分期KIRC患者癌组织，其中miR-29a-3p的表达差异最明显。将miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p可表达水平与KDM5B表达水平进行相关性分析，三者均与KDM5B呈负相关，其中miR-29a-3p与KDM5B的相关性最强。这些研究结果表明，miR-29a-3p可能是调控KDM5B影响KIRC进展的关键因素。本研究双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-29a-3p可靶向调控KDM5B的表达，提示miR-29a-3p可能通过调控KDM5B的表达发挥调控作用。本研究进一步在786-O、Caki-1细胞中沉默miR-29a-3p后发现KDM5B表达均升高，细胞的增殖和侵袭能力均增强，过表达miR-29a-3p后786-O、Caki-1细胞KDM5B表达均降低，细胞的增殖和侵袭能力均降低，进一步支持了miR-29a-3p可能通过靶向下调KDM5B表达抑制KIRC细胞系的增殖与侵袭。本研究的不足之处是缺乏临床试验，仅从数据库分析和细胞实验得出结论，而且目前关于miR-29a-3p/KDM5B作用于KIRC的研究较少，因此未来仍需要进一步研究证实。

综上所述，过表达miR-29a-3p可抑制KIRC细胞系786-O、Caki-1的增殖和侵袭，而沉默miR-29a-3p可促进786-O、Caki-1细胞的增殖和侵袭。其可能的机制是miR-29a-3p通过靶向下调H3K4去甲基化酶KDM5B的表达抑制KIRC细胞增殖和侵袭。本研究结果提示KDM5B可能是潜在的治疗靶点，该结果为KIRC的临床诊疗提供了新的方向。