miR-203a-3p通过靶向LASP1介导Akt/GSK-3β/Snail信号通路调控肝癌细胞生物学行为

董翔 董猛 时晓晓 于若卉 苏君君

作者单位：061000 沧州 河北省沧州中西医结合医院肝胆外科

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，手术和肝移植是早期HCC治疗的基础，目前随着HCC治疗方式的不断改进，靶向治疗也在HCC治疗中占据重要地位，如索拉非尼已被批准用于HCC的一线治疗；然而由于HCC的高复发和高转移特性，患者整体预后仍然较差，尤其是晚期患者的临床治疗效果亟需进一步提升［1-2］。而积极探索、识别HCC发病机制和相关生物标志物对提高HCC临床治疗效果具有重要意义。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种非编码RNA，参与了细胞增殖、分化、迁移、存活和凋亡等生物学过程。miR-203是在14q32.33染色体上发现的miRNA，主要作为肿瘤抑制因子参与人类肿瘤的发生发展［3］。miR-203a-3p是miR-203家族的一员，近年来研究显示miR-203a-3p在调控肿瘤细胞的恶性生物学行为方面起着关键作用［4］。在原发性肝癌患者和HCC细胞系中，miR-203a-3p表达均下降，对HCC细胞增殖、迁移和侵袭也具有调控作用［5-6］。但miR-203a-3p调控HCC细胞生物学行为的相关分子机制尚未明确。LIM和SH3蛋白1（LIM and SH3 protein 1，LASP1）是一种多功能蛋白，参与癌症细胞骨架的重组调控及细胞的侵袭、迁移，可作为癌症预后评估的生物标志物。在临床样本中，LASP1的表达与肿瘤的分级、大小和转移有关，LASP1表达上调可能通过与细胞骨架的相互作用和核易位的增加促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，从而促进肿瘤发展和转移［7］。王贺等［8］检测发现，LASP1在原发性肝癌组织中的表达水平异常升高，其表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移以及TNM分期密切相关，但是LASP1在HCC中的作用机制尚不清楚。本研究分析miR-203a-3p和LASP1对HCC细胞生物学行为的影响，并探索HCC中miR-203a-3p和LASP1的相互作用及其分子机制，以期为临床治疗HCC提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人HCC细胞HepG2购自北京晶莱华科生物技术有限公司。C57BL/6雄性小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0010。小鼠在SPF级屏障环境中饲养，自由饮食饮水。本实验经医院动物伦理委员会批准（批准号：2020121），实验过程中严格遵循“3R”原则。主要试剂与仪器：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国赛默飞公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；RIPA细胞裂解液、ECL化学发光显影试剂盒、CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒均购自上海贝博生物科技有限公司；Matrigel基质胶、Transwell小室购自康宁生命科学（吴江）有限公司；miR-203a-3p模拟物（miR-203a-3p mimics）及阴性对照（miR-NC mimics）、LASP1过表达质粒（pcDNA-LASP1）及阴性对照质粒（pcDNA-NC）购自上海吉玛生物技术有限公司；反转录试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒均购自MedChemExpress公司；LASP1、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、磷酸化GSK-3β（phosphorylated GSK-3β，p-GSK-3β）、Snail、GAPDH抗体、HRP标记的二抗购自上海优宁维生物科技股份有限公司。MCO-170ACL-PC型二氧化碳细胞培养箱购自萊恩生物科技有限公司；CytoFLEX流式细胞仪购自贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；GX53倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；HBS-ScanX全波长酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；全自动医用PCR分析系统购自力新仪器（上海）有限公司。

1.2 细胞培养、分组与转染

将HepG2细胞添加至DMEM完全培养基（10%胎牛血清、1%双抗）中，在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。取对数生长期的HepG2细胞，严格按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书操作，将miR-203a-3p mimics、miR-NC mimics分别转染至HepG2细胞，依次记为miR-203a-3p组、miR-NC组。将miR-203a-3p mimics和pcDNA-NC、miR-203a-3p mimics和pcDNALASP1分别共转染至HepG2细胞，依次记为miR-203a-3p+pcDNA-NC组、miR-203a-3p+LASP1组。以正常培养的HepG2细胞作为对照组（control组）。转染48 h后用qRT-PCR检测转染效率。

1.3 qRT-PCR法检测细胞中miR-203a-3p和LASP1 mRNA的相对表达水平

收集各组转染细胞，加入Trizol试剂提取细胞总RNA，以紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。以cDNA作为模板，根据SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书开展扩增实验。引物序列：miR-203a-3p上游引物为5＇-CCGGTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3＇，下游引物为5＇-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3＇；LASP1上游引物为5＇-CGCGCACAATCCCTACCCATCGCC-3＇，下游引物为 5＇-CTTCCAGAGGAGAGAGTTGGTTCTG-3＇；U6上游引物为5＇-GTAGATACTGCAGTACG-3＇，下 游引物为 5＇-ATCGCATGACGTACCTGAGC-3＇；GAPDH 上游引物为 5＇-GACTCCACTCACGGCAAATTCA-3＇，下游引物为 5＇-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3＇。反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR Green qPCR Master Mix试剂 10 μL，加 ddH2O 至 20 μL。扩增条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行30个循环，以U6和GAPDH为内参基因，用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

1.4 双荧光素酶报告基因检测miR-203a-3p与LASP1的靶向关系

采用Targetscan靶基因预测库预测miR-203a-3p与LASP1的靶向结合位点。构建野生型质粒LASP1-Wt和突变质粒LASP1-Mut后，将其分别与miR-203a-3p mimics、miR-NC mimics共转染至HepG2细胞，记为LASP1-Wt+miR-203a-3p组、LASP1-Wt+miR-NC组、LASP1-Mut+miR-203a-3p组、LASP1-Mut+miR-NC组，细胞培养24 h后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定HepG2细胞的相对荧光素酶活性。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖能力

收集miR-NC组，miR-203a-3p组和miR-203a-3p+LASP1组的HepG2细胞，制成4×103/mL细胞悬液，按100 μL/孔接种至96孔板，在37 ℃、5%CO2条件下孵育培养。培养24 h后，加入CCK-8溶液，10 μL/孔，继续孵育4 h。采用酶标仪检测细胞悬液在450 nm波长下的光密度（OD）值。实验重复3次。

1.6 小鼠异体移植瘤实验

收集miR-NC组，miR-203a-3p组和miR-203a-3p+LASP1组的HepG2细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，随后重悬细胞调整浓度为5×108/mL。小鼠适应性饲养3 d后，按照对应细胞分组进行小鼠实验分组，每组15只。各组小鼠分别于腋下脂肪垫接种对应细胞悬液（100 μL/只），待肿瘤生长30 d后观察肿瘤质量和体积。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

收集细胞悬液接种于6孔培养板中，培养至细胞融合度约90%时，用200 μL的无菌移液头垂直划线，并进行标记，用PBS清洗平板3次，随后置于无血清的培养基中培养，分别于培养0 h、24 h后，移除培养基，在光学显微镜下拍照，采用Image J软件对不同时间点的线性区域之间的划痕距离进行测量，计算细胞迁移率。实验重复3次。

1.8 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

将细胞重悬并计数后，按3×104/孔的密度接种于Transwell小室上室（预先涂有Matrigel基质胶），Transwell小室下室加入600 μL含胎牛血清的培养液，Transwell小室于细胞培养箱中培养24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色10 min，无菌棉签擦去上室未侵袭细胞，染色后的细胞在空气干燥后用流水冲洗3次，在倒置光学显微镜下计数。实验重复3次。

1.9 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率

将细胞重悬并离心后，用400 μL结合缓冲液重悬，调整细胞浓度为1×105/mL，分别加入10 μL Annexin V/FITC和5 μL PI染液，混合均匀，室温下避光孵育15 min，于1 h内在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.10 Western blot法检测相关蛋白的相对表达量

采用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，以BCA检测试剂盒进行蛋白定量，用10%的SDS-PAGE分离蛋白质后，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封膜1 h，洗膜，加入 LASP1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、GAPDH一抗（1∶1 000），4℃下孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的相应二抗，室温下孵育2 h。通过ECL试剂显影，以GAPDH作为内参蛋白，采用Image J软件分析蛋白灰度值。实验重复3次。

1.11 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。正态分布数据以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-203a-3p靶向下调LASP1表达

转染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，qRT-PCR检测结果（图1A和图1B）显示，与control组和miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞中miR-203a-3p表达量升高（t=31.572，30.560；均P＜0.001）；与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞中LASP1 mRNA 表达量降低（t=28.438，P＜0.001）；与miR-203a-3p组和miR-203a-3p+pcDNA-NC组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞中LASP1 mRNA表达量升高（t=17.182，17.351；均P＜0.001）。Western blot检测结果（图1C）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞中LASP1蛋白表达量降低（t=28.155，P＜0.001）。Targetscan软件预测结果（图1D）显示，miR-203a-3p与LASP1存在靶向关系。双荧光素酶报告基因实验结果（图1E）显示，与LASP1-Wt+miR-NC组比较，LASP1-Wt+miR-203a-3p组相对荧光素酶活性下降（t=85.103，P＜0.001），而 LASP1-Mut+miR-203a-3p组与LASP1-Mut+miR-NC组的相对荧光素酶活性比较差异无统计学意义（t=0.127，P=0.895）。以上表明，LASP1是miR-203a-3p的下游靶基因，且miR-203a-3p靶向下调LASP1的表达。

图1 miR-203a-3p靶向下调LASP1表达Fig.1 miR-203a-3p targetedly down-regulated the expression of LASP1

2.2 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞增殖

CCK-8检测结果（图2A）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞增殖活性降低（t=11.460，P=0.007）；与 miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞增殖活性显著升高（t=15.610，P=0.005）。小鼠异体移植瘤实验结果（图2B）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组小鼠移植瘤体积和质量均显著减少（t=89.485，57.319；均P＜0.001）；与miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组小鼠移植瘤体积和质量均增加（t=96.075，48.153；均P＜0.001）。以上结果表明，miR-203a-3p通过靶向下调LASP1抑制HepG2细胞增殖。

图2 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞增殖Fig.2 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell proliferation

2.3 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞迁移

划痕实验结果（图3）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞迁移率降低（t=21.169，P=0.003）；与miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞迁移率显著升高（t=17.825，P=0.007）。表明miR-203a-3p通过靶向下调LASP1抑制HepG2细胞迁移。

图3 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞迁移Fig.3 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell migration

2.4 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞侵袭

Transwell小室实验结果（图4）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞侵袭数目降低（t=22.600，P=0.004）；与miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞侵袭数目升高（t=16.738，P=0.007）。表明miR-203a-3p通过靶向下调LASP1抑制HepG2细胞侵袭。

图4 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞侵袭Fig.4 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited HepG2 cell invasion

2.5 miR-203a-3p靶向LASP1促进HepG2细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI实验结果（图5）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞凋亡率升高（t=45.158，P＜0.001）。与miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞凋亡率降低（t=21.741，P=0.005）。表明miR-203a-3p通过靶向下调LASP1促进HepG2细胞凋亡。

图5 miR-203a-3p靶向LASP1促进HepG2细胞凋亡Fig.5 miR-203a-3p targeting LASP1 promoted HepG2 cell apoptosis

2.6 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞中Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达

Western blot检测结果（图6）显示，与miR-NC组比较，miR-203a-3p组HepG2细胞中p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值、Snail蛋白表达量均降低（t=27.561，31.019，16.450；均P＜0.001）；与 miR-203a-3p组比较，miR-203a-3p+LASP1组HepG2细胞中p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值、Snail蛋白表达量均显著升高（t=18.935，27.410，17.500；P=0.009，0.004，0.008）。表明miR-203a-3p通过靶向下调LASP1抑制HepG2细胞中Akt/GSK-3β/Snail信号通路活化。

图6 miR-203a-3p靶向LASP1抑制HepG2细胞中Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白表达Fig.6 miR-203a-3p targeting LASP1 inhibited the expression of Akt/GSK-3β/Snail signaling pathway related proteins in HepG2 cells

3 讨论

大量研究数据证实，异常表达的miRNAs在HCC的发生、转移及预后中起着至关重要的作用，miRNAs可能是HCC潜在的治疗靶点或诊断、预后生物标志物［9-10］。miR-203a-3p作为角质形成细胞特异性miRNA之一，在肿瘤的发生和进展中具有重要影响［11］。如miR-203a-3p在炎性乳腺癌中表达显著下调，可作为炎性乳腺癌潜在的诊断相关性生物标志物［12］。在结直肠癌中，miR-203a-3p通过靶向调控磷酸二酯酶4D（PDE4D）和Wnt/β-catenin信号通路调控癌细胞增殖、转移及化疗耐药性［13-14］。miR-203a-3p还在胃癌、食管癌等肿瘤细胞恶性生物学行为中发挥调控作用［15-16］。本研究探索miR-203a-3p在HCC细胞恶性生物学行为中的作用，结果显示，转染miR-203a-3p mimics后，HepG2细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显降低，细胞凋亡率明显升高，肿瘤细胞在异体移植小鼠体内生长的速度也明显降低。表明过表达miR-203a-3p可抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，可作为HCC治疗的候选靶点。

既往研究［17-18］已显示，LASP1在HCC组织和细胞系中表达上调，且被鉴定为miR-133b和miR-326的直接靶基因，miR-133b和miR-326可能通过直接靶向LASP1抑制HCC生长和转移。但在HCC中miR-203a-3p和LASP1的靶向关系尚未见报道。本研究通过Targetscan软件预测HCC中miR-203a-3p与LASP1的靶向关系，结果发现miR-203a-3p与LASP1存在靶向关系。双荧光素酶报告基因检测结果显示，转染miR-203a-3p mimics可明显降低野生型LASP1基因的相对荧光素酶活性，且HepG2细胞中LASP1 mRNA和蛋白表达量均明显降低，表明在HCC中miR-203a-3p靶向负调控LASP1的表达。本研究还发现，共转染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，HepG2细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显升高，细胞凋亡率明显降低，且肿瘤细胞在异体移植小鼠体内生长的速度也明显增高。说明LASP1可逆转miR-203a-3p对HepG2细胞恶性生物学行为的调控作用。以上结果表明miR-203a-3p可能通过靶向负调控LASP1表达调控HCC细胞恶性生物学行为。

Akt/GSK-3β/Snail信号通路在血管生成、肿瘤侵袭和转移等许多生理病理过程中发挥作用［19］。在Akt/GSK-3β/Snail信号通路中，Akt受到上游信号刺激发生磷酸化，活化的Akt能够启动下游级联反应，激活下游GSK-3β。由于Snail序列中存在GSK-3β保守结合位点，GSK-3β与Snail结合可诱导Snail在细胞内的稳定和核定位［20-21］。当GSK-3β磷酸化后，其与Snail的结合作用解除，这使细胞内的Snail表达水平上调，最终促进侵袭、转移等病理过程的发生［22］。已有研究［23-25］发现，Akt/GSK-3β/Snail信号通路在上皮卵巢癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤中过度激活，并且参与肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究检测HCC细胞中Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关蛋白的表达情况，结果发现转染miR-203a-3p mimics后，HepG2细胞中p-Akt、p-GSK-3β和Snail蛋白表达水平均明显降低，说明miR-203a-3p可抑制HCC中Akt/GSK-3B/Snail信号通路活化。而共转染miR-203a-3p mimics和pcDNA-LASP1后，HepG2细胞中p-Akt、p-GSK-3β和Snail蛋白表达水平均明显升高，提示LASP1可逆转miR-203a-3p对HepG2细胞中Akt/GSK-3β/Snail信号通路的抑制作用。以上结果表明miR-203a-3p可能通过靶向LASP1介导HCC中Akt/GSK-3β/Snail信号通路活性，从而调控HCC细胞生物学行为。

综上所述，过表达miR-203a-3p可抑制HCC细胞增殖、生长、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与靶向LASP1介导Akt/GSK-3β/Snail信号通路活性有关，表明miR-203a-3p/LASP1轴可能是HCC潜在的治疗靶点。本研究结果为进一步阐明肝癌的发病机制及其复发和转移的诊疗提供了新思路。