乳酸菌发酵铁皮石斛活性成分与抗氧化功能动态分析

黄 庆，林华嗣，王国鑫，胡晓波

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西九草铁皮石斛科技协同创新有限公司，江西 鹰潭 335000)

铁皮石斛是一种兰科石斛属草本植物，主要分布于我国云南、广西、贵州、浙江、江西等地的山区[1]，并享有“救命仙草”的美誉。许多研究表明，铁皮石斛含有多糖、矿物质、氨基酸、石斛碱、多酚、黄酮等营养成分[1-3]，具有降血糖、调节肠道菌群、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等多种活性功能。铁皮石斛作为一种食药同源品种，主要被加工成铁皮枫斗，或浸酒、炖汤。随着人工种植技术的突破，铁皮石斛的产量不断增加，如何对铁皮石斛进行现代化加工成为迫切需要解决的问题。

发酵作为一种传统的食品加工方法，通过微生物的作用可降解抗营养因子，生成生物活性物质，增加活性成分的生物利用度[4,5]。例如，酵母菌发酵铁皮石斛水提液能降低多糖的分子量，提高石斛发酵液的生理活性[6]。通过发酵得到的铁皮石斛多糖具有良好的自由基清除能力，以及出色的金属螯合活性[7]。在芒果皮的发酵中，乳酸菌作为活性发酵剂能提高发酵液中的总酚含量[8]。王丹等[9]研究发现采用乳酸菌、霉菌等不同菌种发酵铁皮石斛粗多糖水提液，能提高其抗氧化活性和降血糖活性。有研究发现混菌发酵通过多菌种协同发酵作用，使发酵液具有更丰富的风味和柔和的口感，含更多的活性功能成分，同时还可以使产品保持较高的贮藏品质[10]。

铁皮石斛为开发健康食品提供了良好的来源，如铁皮石斛酸奶[11]、铁皮石斛红枣复合功能性果汁[12]等。实验以铁皮石斛鲜条为原料，乳酸菌为发酵菌种，对铁皮石斛汁发酵过程中的活性成分以及抗氧化能力进行动态分析。目的在于分析乳酸菌在发酵过程中对铁皮石斛品质的影响以及了解铁皮石斛乳酸菌发酵饮品的潜在营养价值，为开发高活性乳酸菌饮料提供一定的可行性分析和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛：江西轩斛生物科技有限公司提供。

植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌：山东中科嘉亿生物工程有限公司。

MRS肉汤培养基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林酚、没食子酸、琼脂购自北京索莱宝科技有限公司；2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、水杨酸购自阿拉丁；芦丁(上海源叶生物科技有限公司)，其他药品试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

SW-CJ双人净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；PHS-2F型数字pH计，上海精密仪器有限公司；ZQTY-70E振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；BSP-100生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU-1810DAPC紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TGL216G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；YXQ-50SII立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JS-THERMO多功能酶标仪，美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵菌种的活化

将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌接种于100 mL的MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温培养48 h后进行二次传代，菌种充分活化后的种子菌液放4 ℃冰箱保存。

1.3.2 铁皮石斛发酵原液的制备

将洗净的铁皮石斛切断，沸水灭酶2～3 min，将烫漂好的铁皮石斛段与蒸馏水按照料液比1:10打汁，置于250 mL无菌锥形瓶85 ℃，20 min灭菌。

1.3.3 接种与发酵

选择植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌(植+嗜)，植物乳杆菌+副干酪乳杆菌(植+副)，嗜酸乳杆菌+副干酪乳杆菌(嗜+副)3种混菌发酵以1:1的比例接种2%(v/v)的活化菌液，在37 ℃恒温发酵72 h。发酵过程中在12，24，36，48，72 h进行取样，于4 ℃冰箱保存。

1.3.4 测定指标及方法

1.3.4.1 乳酸菌活菌数的测定

根据GB4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行测定。

1.3.4.2 pH的测定

使用pH计对发酵过程中pH值的变化进行测定。

1.3.4.3 总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[13]进行测定，略有改动。取25 μL发酵液至25 mL具塞试管中用蒸馏水补足至1 mL，在通风橱中依次加入5%苯酚试剂1 mL，浓硫酸5 mL，混合均匀，沸水浴20 min后立刻冰水浴5 min，488 nm处测量吸光值。线性回归方程：y=48.75x+03557，R2=0.9994。

1.3.4.4 总酚含量的测定

采用福林酚法[14]进行测定，略有改动。取0.8 mL发酵液至25 mL具塞试管中，依次加入0.3 mL福林酚试剂，1.5 mL 7%碳酸钠溶液后用蒸馏水补足至10 mL，避光反应20 min后测量760 nm处的吸光度。线性回归方程：y=0.0986x+00606，R2=0.9995。

1.3.5 抗氧化能力的测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考文献[15]并加以改进，取100 μL的发酵液，100 μL,0.1 mmol·L-1的DPPH-95%乙醇溶液加入96孔板中，37 ℃避光反应30 min，用去离子水做参比，在517 nm下测定吸光值。空白组将去离子水替代发酵液，对照组将95%乙醇替代DPPH-95%乙醇溶液。

1.3.5.2 羟基自由基清除能力的测定

参考文献[16]并加以改进，向96孔板依次加入9 mmol·L-1FeSO450 μL，9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液30 μL，发酵液20 μL，8.8 mmol·L-1H2O240 μL和50 μL去离子水，充分混匀，37 ℃避光反应15 min，510 nm处测定吸光值，用去离子水做参比。空白组将去离子水替代发酵液，对照组用无水乙醇替代水杨酸-乙醇溶液。

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力的测定

参考文献[17]并加以改进，取5 mL、7 mmol·L-1的ABTS溶液，加入88 μL 140 mmol·L-1的过硫酸钾溶液混合均匀，室温下过夜避光反应，得到ABTS工作母液。用去离子水对其进行适当的稀释，使其在734 nm处的吸光值为0.7±0.02，得到最终的ABTS工作液。取30 μL发酵液，200 μL ABTS工作液加入到96孔板中充分混匀后37 ℃避光反应6 min，在734 nm下测得吸光值。空白组将去离子水替代发酵液，对照组用去离子水替代ABTS工作液。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 发酵液中活菌数的变化

由图1可知，3种乳酸菌混菌发酵液的活菌数有相同的变化趋势。在发酵前期均没有出现明显的滞后期，说明铁皮石斛是乳酸菌生长繁殖的良好底物。在发酵前中期活菌数呈现指数性增长，并在24 h处达到最大值8.72 lg(CFU/mL)，随后发酵进入衰亡期，活菌数出现不同程度的下降并最终保持稳定。在红甜菜和枸杞汁的研究中乳酸菌活菌数也有相同的变化过程[18,19]。发酵进入衰亡期的原因主要与发酵基质以及发酵环境有关，未额外添加碳源会导致营养物质快速消耗，pH的不断下降也制约着乳酸菌的繁殖[20]。在整个发酵周期中，3种混菌发酵液的活菌数均能达到8.00 lg(CFU/mL)，显著高于起始值，且直到发酵终点仍保留有7.00 lg(CFU/mL)的活菌数目，能发挥一定的益生作用。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)图1 铁皮石斛发酵过程中活菌数的变化Fig.1 Change of viable bacteria count during dendrobium officinale fermentation

2.2 发酵过程中pH的变化

由图2可知，随着发酵时间的增加，发酵液的pH值呈现出不断下降的变化，这是因为在发酵过程中乳酸菌产生了各种有机酸，比如柠檬酸、苹果酸和乳酸等[21]。结果显示pH在乳酸菌的指数生长期快速下降，说明产酸能力强，这与前人的研究一致[22]。在发酵过程中，植+嗜的pH下降速率低于其他两组，造成结果的原因可能是乳酸菌产酸能力的差异，每一种乳酸菌都有不同的代谢酶系，有机酸的产生和转化主要与乳酸菌的糖酵解代谢和半乳糖代谢途径有关[23]。与发酵初始值相比，发酵后的pH显著下降，最低可达3.15。试验选择的乳酸菌在铁皮石斛汁中都能发挥较强的产酸能力。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)图2 铁皮石斛发酵过程中pH的变化Fig 2 Change of pH during Dendrobium officinale fermentation

2.3 发酵过程中活性成分的变化

2.3.1 总糖含量的变化

由图3可知，随着发酵时间的增加总糖含量不断下降。在整个发酵周期总糖含量整体上是呈下降趋势的，在发酵后期趋于平缓。发酵72 h后发酵液(植+嗜)和发酵液(植+副)总糖含量分别降低了42.31%和40.72%，而发酵液(嗜+副)只降低了24.89%。下降的原因是随着乳酸菌的不断增长，发酵液中的糖类被微生物利用[5]。从结果可以看出，3种混菌发酵对总糖的影响程度各不相同，这是因为不同的菌有不同的代谢途径。多糖含量是铁皮石斛功能活性的考察指标之一，在发酵过程中可以尝试通过补加碳源作为底物，以抑制多糖含量的降低。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)图3 铁皮石斛发酵过程中总糖含量的变化Fig 3 Change of total sugar content in Dendrobium officinale during fermentation

2.3.2 总酚含量的变化

由图4可知，随着发酵时间的增加，铁皮石斛发酵样液中的总酚含量不断增加，在24 h处达到最大值，分别达到34.00(植+嗜)，34.32(植+副)，35.32 mg·L-1(嗜+副)，随后开始下降，发酵结束总酚含量仍然高于未发酵的铁皮石斛汁。由此可见，乳酸菌发酵能明显提高铁皮石斛汁中的总酚含量。其原因可能是乳酸菌在代谢过程中通过解聚或者相关酶的作用影响着多酚类物质含量[24,25]。在发酵后期，总酚不断下降可能的原因是乳酸菌进入衰亡期，代谢活动减弱导致多酚的增加量减少，以及与一些大分子物质发生相互作用，产生沉淀以及被氧化，导致多酚物质的损失[9]。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)图4 铁皮石斛发酵过程中总酚含量的变化Fig 4 Change of total phenolic content in Dendrobium officinale during fermentation

2.4 发酵过程中抗氧化能力的变化

2.4.1 DPPH自由基清除能力的变化

由图5可知，经过乳酸菌的发酵可以显著提高铁皮石斛汁的DPPH自由基清除能力，在0～72 h过程中发酵液的清除能力总体呈现先增加后保持稳定或略有下降。植+嗜、植+副、嗜+副发酵液分别在48，36和24 h达到最大值，其中嗜+副对DPPH自由基的清除能力在发酵24 h处达62.84%，比发酵前提高了90.60%。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)。图5 铁皮石斛发酵液DPPH自由基清除能力Fig 5 DPPH free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

不同的菌有不同的发酵特性，从而导致最佳的发酵时间清除能力有所不同。研究表明DPPH自由基的清除能力与咖啡酸、芦丁和肉桂酸的含量呈显著正相关[26]。乳酸菌发酵提高了铁皮石斛发酵液的多酚，可能是其清除DPPH自由基能力提高的原因之一；但同时活性多糖含量、分子量下降[27]也会影响其抗氧化效果，所以活性多糖含量和分子量的变化对其抗氧化能力的影响，还需深入研究。

2.4.2 羟基自由基清除能力的变化

由图6可知，乳酸菌发酵能提高铁皮石斛汁的羟基自由基清除能力，在整个发酵过程中其变化趋势与DPPH自由基清除能力类似。发酵样液植+副和嗜+副在24 h处达到最大值分别为64.24%和68.21%，而植+嗜在36 h达到最大值66.22%，其中增幅最高的是嗜+副32.73%。不同发酵液的羟基自由基清除能力不同，自由基的清除能力不仅仅与多酚含量有关，可能还与多酚的组成不同有关[28]。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)。图6 铁皮石斛发酵液羟基自由基清除能力Fig 6 Hydroxyl free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.4.3 ABTS自由基清除能力的变化

由图7可知，铁皮石斛发酵液的ABTS自由基清除能力变化情况与DPPH自由基和羟基自由基相似，其中增幅最高可达41.42%(植+副)。同样的ABTS自由基清除能力的提高可能和多酚有关，相关研究中得出发酵后的多酚提取物能显著提高ABTS自由基的清除率[29]。3种混菌对自由基清除的影响具有显著性差异，这可能是发酵液中多酚组成的影响，以及每种多酚化合物对自由基清除能力的贡献具有差异性[30]。

t/h注：不同的小写字母表示差异显著性(P<0.05)。图7 铁皮石斛发酵液ABTS自由基清除能力Fig 7 ABTS free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.5 发酵铁皮石斛汁活性成分与抗氧化能力相关性分析

由表1可知，发酵液(植+副)的总酚含量与羟基自由基清除率和ABTS自由基清除率呈显著正相关性，发酵液(嗜+副)的总酚含量与羟基自由基清除率呈显著正相关性(p<0.05)；发酵液(植+副)的总糖含量与DPPH自由基清除率呈极显著负相关性(p<0.05)，(嗜+副)的总糖含量与ABTS自由基清除率呈显著负相关性，其他自由基清除率与总糖含量无明显相关性。有研究[31]发现抗氧化活性主要与酚酸和黄酮含量密切相关；黄凯伟等[32]的研究推测多糖含量与抗氧化活性无相关性的原因是由于铁皮石斛水溶性多糖抗氧化活性差造成的。从相关性分析结果来看酚类物质在提高发酵液抗氧化能力中起重要作用。

表1 发酵液活性成分与抗氧化能力相关性分析Tab 1 Correlation analysis between active components and antioxidant capacity

3 结论与讨论

研究采用3个混菌组发酵铁皮石斛汁，结果表明3个混菌组中的乳酸菌均能在铁皮石斛汁中良好生长，在整个发酵过程中(0～72 h)，pH下降明显；总糖含量呈现不同的下降趋势，其中嗜+副的总糖消耗最少；同时，嗜+副发酵后活菌数、总酚、对DPPH自由基的清除能力和羟基自由基的清除能力提高最多。后续试验可以通过额外添加碳源，减少乳酸菌对总糖的消耗，提高乳酸菌的生物转化效率，进一步提升铁皮石斛的开发品质。

在体外抗氧化能力中，发酵液对DPPH自由基的清除能力的增幅要高于羟基自由基清除能力和ABTS自由基清除能力，不同的混菌发酵有不同的提升效果，且最佳发酵时间也各不相同。经过乳酸菌的发酵，铁皮石斛汁的抗氧化能力有不同程度的增大，可能与多酚类物质的增加和组成有关；有研究表明乳酸菌发酵将大分子多糖转化成活性更强的小分子多糖也可能提高其抗氧化能力，乳酸菌产生的胞外多糖也具有一定程度的抗氧化活性。发酵过程中，活性多糖和多酚对其抗氧化能力的影响，还需深入研究。

综上所述，3种乳酸菌混菌发酵均能在不同程度上改善铁皮石斛汁的品质，不同的混菌发酵有不同的最佳发酵时间，且发酵12～36 h是比较适宜的。乳酸菌发酵铁皮石斛不仅能显著改善铁皮石斛汁的品质，也赋予铁皮石斛汁独特的功能活性。此外，由于整个发酵过程没有使用食品添加剂，试验可为开发铁皮石斛乳酸菌发酵清洁标签食品提供一定的数据支持和理论依据。发酵可作为增强铁皮石斛功能和开发铁皮石斛健康品的重要手段之一。