发酵液中透明质酸提取纯化工艺的研究

宋磊+孟国庆+郭燕风+王传宝+王宜磊

摘要：本研究利用乙醇初步提取发酵液中透明质酸，确定最佳提取方案为乙醇体积分数60%，洗涤次数为两次。然后，以透明质酸含量为指标，在单因素试验的基础上，采用根据Box-Behnken原理设计的响应面法优化透明质酸纯化工艺。方差分析和交互作用分析表明，最佳纯化工艺为NaCl浓度45 g/L，温度55℃，pH值9.6，在此工艺条件下，透明质酸含量为93.71%。本工艺所生产的透明质酸纯度較高，符合化妆品、医药行业标准，具有广泛的应用价值。

关键词：透明质酸；发酵液；分离纯化；响应面

中图分类号：TS218文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）03-0134-06

AbstractIn this research， the hyaluronic acid was preliminarily extracted from fermentation broth using alcohol. The best extraction parameters were ethanol volume fraction of 60% and washing for two times. Using the content of hyaluronic acid as indicator， single-factor experiments were performed. Then the response surface analysis based on Box-Behnken experimental design was carried out to optimize the purification process of hyaluronic acid. Through analysis of variance and interaction， the optimal purification process was NaCl additive amount of 45 g/L， temperature of 55℃ and pH value of 9.6. Under the optimized conditions， the actual content of hyaluronic acid reached up to 93.71%. By this process， the content of hyaluronic acid was higher， which conformed to the stands of cosmetic and pharmaceutical industries， so it had extensive application value.

KeywordsHyaluronic acid； Fermentation broth； Separation and purification； Response surface

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种高分子量的酸性黏多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成[1]，由于其独特的流变学特性、黏弹性、保湿性以及良好的生物相容性，透明质酸在化妆品、医学领域都有广泛的应用[2]。透明质酸用于食品领域还处于起步阶段。近年来国内外关于HA口服后吸收、代谢和功效的研究越来越多，大量科学证据证明了其功效。特别是2008年5月，国家卫生部按照《新资源食品管理办法》的规定发布相关公告，批准透明质酸钠作为一种新资源食品用于保健食品原料。这一公告的发布必将进一步推动HA在我国保健食品中的应用。

微生物发酵法是目前透明质酸的主要生产方式，而下游分离纯化工艺是获得高纯度HA的关键环节，也是制约多数企业生产高标准透明质酸的瓶颈。根据透明质酸国家质量标准和行业标准，成品中热源蛋白质含量越低，透明质酸含量越高，产品质量越高。因此，除去发酵液中的热源蛋白是透明质酸分离纯化的首要任务。

依据文献，从发酵液中分离提纯透明质酸主要有大量稀释膜滤法、季铵盐法、氯仿法、酶法、离子交换层析等[3-5]，这些方法存在生产成本高、操作复杂、纯度和回收率低、环境不友好等诸多缺点，不利于在工业中应用。本研究利用乙醇对发酵液中透明质酸进行初步粗提，之后采用响应面法优化纯化工艺，得到了纯度和产率都较高的透明质酸，并在山东某透明质酸生产工厂得到应用，具有较大的实际生产参考价值。

1材料与方法

1.1材料与仪器

透明质酸发酵液：山东某透明质酸生产公司提供；β-葡萄糖醛酸：购自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）：购自北京欣经科生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯；水为二次去离子水。

UV-1910型紫外-可见分光光度计（北京普析），D2F-6090真空烘箱（上海精宏实验设备有限公司），LXJ-ⅡB 低速大容量离心机（上海精密仪器仪表有限公司），79480型真空冷冻干燥机（Labconco 公司），ALC-1100型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1工艺流程透明质酸发酵液→乙醇粗提→洗涤→溶解→纯化→过滤→调整pH值→95%乙醇沉淀→真空冷冻干燥→成品。

1.2.2透明质酸粗提①粗提乙醇体积分数的选择：在快速搅拌下，分别向1 000 mL新鲜HA发酵液中加入95%的乙醇，使混合液中乙醇终体积分别控制在30%、40%、50%、60%、70%。加入过程需缓慢，避免大结块沉淀产生。加入完毕后快速搅拌10 min，静置1 h后置于1 000 r/min离心机中离心5 min。取沉淀，测HA含量，考察添加不同体积乙醇对于HA提取量的影响。②洗涤次数的确定：取离心后沉淀，加入300 mL 95%乙醇进行洗涤，洗涤次数分别为1、2、3次。考察洗涤次数对于溶液透光率、HA提取量的影响。③透明质酸溶解方案的确定：取洗涤后沉淀，加入1 500～4 000 mL去离子水进行溶解。以溶解后粘度作为确定溶解相应方案的指标。