发酵生产维生素B12的检测与提取研究

王利杰

摘 要：采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）检测了发酵液中维生素B12的含量，使用费氏丙酸杆菌细胞破碎提取维生素B12。结果显示，羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素的回收率分别为92.43%，97.56%和96.45%.费氏丙酸杆菌的质量浓度分别为43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。经超声波破碎，经测定，维生素B12的产量分别为13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。维生素B12经微波加热法获得的提出率最大，其次为煮沸法、超声法和高压均质法。HPLC具有良好的重复性和较快的分析速度，而在费氏丙酸杆菌细胞破碎提取中，微波加热法和煮法法值得推广。

关键词：发酵液；维生素B12；高效液相色谱法；超声波

中图分类号：TQ924 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2016.22.106

维生素B12又被称为钴胺素，主要是通过微生物发酵获取的，其被广泛应用于医药、食品工业等方面。在实践中，常见的检测方法有微生物法、间接检测法等，其中，HPLC的使用频率最高。但是，因为维生素B12的发酵周期过长、发酵物种繁多，所以，急需构建准确、简便、高效的检测方法。目前，关于维生素B12的检测和提取的研究报道比较少。因此，本文利用HPLC检测了维生素B12，并借助大孔树脂吸附法进行了提取，效果显著，具体情况如下。

1 实验材料

实验一：费氏丙酸杆菌，质量分数为5%的玉米浆，质量分数为2%的葡萄糖，质量分数为0.2%的硫酸铵，高效液相色谱仪，超声波细胞破碎仪，高速离心机，大容量离心机，纯水机，分析纯，色谱柱为5 μm，（4.7×25.0）cm。

实验二：菌种、培养基同实验一，采用高效液相色谱仪，高速离心机，大容量离心机，超声波细胞破碎仪，微波炉，高压均质机，考马斯亮蓝染液，色谱柱5 μm，（4.7×25.0）cm。

2 实验方法

实验一：培养费氏丙酸杆菌，利用生理盐水清洗菌体，静置30 ℃，培养50 h。接种发酵培养基后，静置30 ℃，培养100 h，发酵后40 h，添加二甲基苯并咪唑，诱导菌体，积累维生素B12，离心4 000 r/min，获取菌体。具体实验有，重复性实验、稳定性试验、回收率实验，即称取5份菌体，质量相同，制备样品，添加等量羟基钴胺素和甲基钴胺素，置于4 ℃冰箱内，避光保存，检测间隔时间为1 h/次，分析样品5 h内的稳定性。

实验二：配置不同浓度的血清白蛋白溶液，取0.1 mL，加入考马斯亮蓝染液5 mL。维生素B12的提取方法有4种，即超声法，称取菌体，放置在小烧杯内，离心后，溶解菌体，选取不同时间，探讨其提取效率，取上清，测定蛋白质释放率，除蛋白质后测定维生素B12的含量；煮沸法，定容后，煮沸，离心，过滤上清液后，测定维生素B12的含量。此外，还包括微波加热法和高压均质法，此处不一一阐述。

3 实验结果

实验一：细胞破碎液处理后，获得了HPLC色谱图，羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素均在25 min内完全分离，各自保留时间为10.9 min、18.5 min、22.4 min，细胞破碎液中杂质6 min内被洗脱，借助梯度洗脱，分离了脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。三类不同浓度的钴胺素与色谱峰面积呈线性关系，因其对光线敏感，操作时应避光，质量浓度为10～200 μg/mL，三者线性关系良好。维生素B12经重复性实验，5次实验标准偏差均低于2.5%，均在允许误差范围内。此结果表明，仪器具有较高的精密度，分析方法具有良好的重复性。稳定性实验，维生素B12置于避光环境中，5 h内稳定，三者的回收率分别为92.43%，97.56%，96.45%. 费氏丙酸杆菌的质量浓度分别为43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。经超声波破碎，测定维生素B12的产量分别为13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。

实验二：费氏丙酸杆菌菌体采取不同的方法提取维生素B12，提出率最大的为微波加热法，其次为煮沸法、超声法和高压均质法，分别为100.00%，97.67%，89.65%和88.63%.

4 讨论

经微生物发酵获取维生素B12常见的有羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。为了快速测定发酵液中维生素B12的含量，本文采用了HPLC方法，离心后，得到了菌体，待预处理后使用醋酸钠缓冲液为流动相。实验结果为检测方法精准。在钴胺素类物质检测中使用HPLC，优势显著，准确、快速，具有良好的重复性。因此，该方法可用于钴胺素工业发酵生产。在实践过程中，可以对维生素B12进行定量分析，其应用价值显著，值得推广。

维生素B12为细胞内产物，在提取时关键环节便是破碎细胞，其对产物有直接的影响，比如活性、收率、成本等。因此，在實践过程中，应确保细胞破碎方法具有合理性、针对性和有效性。目前，常见的细胞破碎方法有2种，一种为机械法，另一种为非机械法，前者包括株磨法、超声波法，后者包括化学法、物理法等。为了指导实践，使维生素B12提取更加简便，本文对比了不同提取方法，取得了良好的效果。其中，微波加热法的提取时间最短，但是，在工业应用中，需要借助大型配套设备。此外，煮沸法优点显著，提取效率高，处理量大，仅需简单的设备，值得推广。

参考文献

[1]王泽建，赵琳琳，储炬，等.脱氮假单胞菌生产维生素B12过程中粪卟啉Ⅲ的测定及发酵调控[J].中国生物工程杂志，2011，14（08）：47-53.

[2]李志春，郭海蓉，麻少莹，等.甘蔗糖蜜发酵液中维生素B12提取方法的比较[J].南方农业学报，2013，10（07）：1710-1713.

〔编辑：白洁〕