慢性萎缩性胃炎患者胃黏膜组织中TFF2、miR-181a、RKIP的表达及相关性研究

李 霞，杨 云，王慧纬，王丙信

中国人民解放军陆军第八十一集团军医院消化内科，河北张家口 075000

慢性萎缩性胃炎(CAG)是一种与幽门螺杆菌(Hp)感染密切相关的疾病，会造成胃黏膜上皮和腺体萎缩，黏膜肌层增厚及肠上皮化生、不典型增生等，同时，作为癌前病变，它最终可能导致胃癌的发生[1-4]。为此，对CAG的精准诊断有着非常重要的意义。多种生物标志物的表达都与CAG相关，比如，三叶因子2(TFF2)、miR-181a和Raf激酶抑制蛋白(RKIP)等，它们在CAG向胃癌的发展过程中起保护胃黏膜和抑制肿瘤的作用[5-7]。但是，以往研究仅浅显地对CAG患者的上述生物标志物的表达水平进行了分析，未进行与患者临床特征的关系研究。因此，本研究采用回顾性分析方法，深入研究了TFF2、miR-181a和RKIP在CAG患者胃黏膜组织中的表达，并对3项指标与患者临床特征的关系进行了研究，以期为CAG的诊疗提供新的手段。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2021年3月于本院进行胃镜检查的115例CAG患者为CAG组，均按《中国慢性胃炎共识意见》[8]标准，并经过胃镜检查和组织病理活检确诊，其中男60例，女55例。同期在本院进行胃镜检查的体检健康者120例作为健康对照组，其中男63例，女57例。纳入标准：(1)有完善的临床资料；(2)近1个月内未服用过可能会对本研究试验结果产生影响的药物；(3)无胃部相关损伤，适合做胃镜检查；(4)无其他器官及免疫系统功能异常；(5)无任何其他可能会影响试验结果或不适合进行相关试验的因素。排除标准：(1)合并胃黏膜糜烂、胃出血、消化性溃疡等；(2)合并心脑血管或其他器质性疾病；(3)合并胃癌等肿瘤。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2仪器与试剂 所用仪器主要包括移液器(美国赛默飞公司)、烘箱(德国德菲瑞斯公司)、石蜡切片机(德国徕卡公司)、摊片机(东莞科迪仪器有限公司)、IMS图像分析系统(德国徕卡公司)、光学显微镜(德国徕卡公司)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪(美国赛默飞公司)、高压灭菌锅(美国施都凯公司)、超低温冰箱(青岛海尔公司)、分光光度计(美国赛默飞公司)、高速离心机(美国赛默飞公司)。所用试剂主要包括兔抗人TFF2多克隆抗体(美国SAB公司)、兔抗人RKIP抗体(北京义翘神州科技有限公司)、SP免疫组化试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，1X磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)、Trizol试剂盒(北京酷来博科技有限公司)、RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、mRNA反转录试剂盒(美国EZBioscience公司)、绿色荧光RNA定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、内参基因U6(湖北百奥斯生物科技有限公司)、miR-181a引物(北京擎科生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 在胃镜检查过程中，采用活检钳采集研究对象的胃黏膜组织标本。

1.3.2免疫组化法检测TFF2和RKIP的表达水平 取受试者胃黏膜组织后，首先采用PBS冲洗，然后经过多聚甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、5 μm切片、贴片、烤片等一系列步骤，制成石蜡切片。随后，严格按照SP免疫组化试剂盒使用说明书进行免疫组化相关试验。每例研究对象选择5个×400视野，应用IMS图像分析系统采集光密度值，取这5个视野的平均值作为免疫组化法检测结果。

1.3.3RT-PCR检测miR-181a表达水平 RT-PCR检测参考LUO等[9]的方法并进行了适当改动。按Trizol试剂盒的说明书进行RNA的提取，采用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，严格按照试剂盒说明书内容进行反转录，最终合成cDNA。随后，按照RNA荧光定量试剂盒使用说明进行RT-PCR。引物序列：miR-181a正向引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC-3′，反向引物为5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGT CG-3′；β-actin正向引物序列为5′-TCGATCGATGCTAGCTAT-3′，反向引物为5′-TAGCATAGCTA GCTAGCT-3′；产物长度为135 bp。反应条件：95 ℃ 6 min预变性；95 ℃ 10 s变性；60 ℃ 15 s退火；72 ℃ 30 s延伸；50个循环。反应完成后，分析熔解曲线，以β-actin作为内参照，利用2—ΔΔCt计算miR-181a表达水平。

1.4观察指标 (1)利用IMS图像分析系统采集的TFF2和RKIP的光密度值；(2)利用2—ΔΔCt计算的miR-181a的表达水平。

2 结 果

2.1两组基线资料比较 两组研究对象性别及居住地比例、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CAG组有饮酒史、吸烟史比例高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 患者基线资料对比

2.2两组TFF2、RKIP和miR-181a表达水平比较 与健康对照组比较，CAG组的TFF2和miR-181a表达水平升高，RKIP表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

2.3不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表达水平比较 不同发病部位、幽门螺杆菌(Hp)感染史、胃炎/胃癌家族史、饮食习惯规律情况CAG患者间的TFF2、RKIP和miR-181a表达水平不同，差异有统计学意义(P<0.05)。以胃窦为主的CAG、全胃CAG患者TFF2表达水平低于以胃体为主的CAG患者(P<0.05)；miR-181a表达水平在以胃窦为主的CAG、以胃体为主的CAG、全胃CAG中依次升高(P<0.05)；RKIP表达水平在以胃窦为主的CAG、以胃体为主的CAG、全胃CAG中依次降低(P<0.05)。不同年龄、性别、胃炎/胃癌家族史情况CAG患者间TFF2、RKIP和miR-181a表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组TFF2、RKIP和miR-181a表达水平比较

2.4TFF2、miR-181a与RKIP表达水平之间的相关分析 TFF2表达水平与miR-181a表达水平呈正相关(r=0.345，P=0.045)，TFF2、miR-181a表达水平与RKIP表达水平均呈负相关(r=—0.326，P=0.047；r=—0.625，P=0.008)。

2.5Logistic回归分析影响CAG发生的风险因素 Logistic回归分析发现，年龄≥50岁、发病部位以胃窦为主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、饮食习惯不规律均为影响CAG发生的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

注：A为TFF2在健康对照组中低表达；B为TFF2在CAG组中高表达；C为RKIP在健康对照组中高表达；D为RKIP在CAG组中低表达。

表3 不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表达水平比较

表4 Logistic回归分析影响CAG的风险因素

3 讨 论

CAG是一种以胃黏膜萎缩等为主要临床特点的胃部疾病，发病机制复杂，与Hp感染、免疫、年龄、饮食习惯和遗传因素等息息相关，如不给予适度的关注，易发展成为胃癌，进而危及患者的生命[9-11]。本研究结果显示，健康对照组和CAG组有饮酒史和吸烟史比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示吸烟和饮酒可能是CAG发生的影响因素。

TFF2是三叶因子家族的一员，三叶因子家族成员还包括TFF1和TFF3。其中，TFF2可通过在胃部和十二指肠等消化器官中进行特异性表达，通过抑制胃酸的分泌，与黏液蛋白结合等降低胃黏膜可能受到的伤害，并与表皮生长因子和转化生长因子协同作用，实现对胃黏膜的保护和修复[12]。生理情况下，TFF2主要来自于胃窦并表达于细胞质[13]。本研究结果显示，TFF2表达水平在有Hp感染史、胃炎/胃癌家族史患者中升高，表明TFF2表达水平升高可能伴随着CAG的发展进程。同时，以胃窦为主的CAG和全胃CAG患者的TFF2表达水平低于以胃体为主的CAG患者(P<0.05)，胃窦部位的功能损伤可能会抑制TFF2的表达，从而使胃部逐渐丧失自我保护功能。除此之外，规律的饮食习惯也可对CAG产生重要影响，且应减少过热、过咸及辛辣食物的食用。miR-181a与细胞的多种功能都有联系，比如，在胃炎的发展中，miR-181a表达水平与多种因素有关，可以作为反映病情的参考指标[14]。又比如，miR-181a在癌症的发病机制中，既可以作为癌基因的诱导因素，又可以通过对癌基因进行抑制，从而限制肿瘤的发展[15-18]。本研究发现，不同发病部位、Hp感染史、胃炎/胃癌家族史、饮食习惯规律情况的CAG患者间miR-181a表达水平不同，差异有统计学意义(P<0.05)。CAG是发生胃癌的前兆，因此，miR-181a的表达水平升高很可能预示着患者癌症风险的逐步增大。RKIP是一种小分子保守蛋白，能够调节信号通路，对ERK信号进行负调控[19]。RKIP在人体的广泛表达可以有效抑制癌细胞的生长和转移[20]。TFF2表达水平与RKIP表达水平呈负相关(r=-0.326，P=0.047)，表明胃黏膜组织随着病情的恶化，对癌细胞的抑制力也在逐渐降低。miR-181a的高表达和RKIP的低表达，协同增加了CAG向胃癌转变的风险。

许多研究者对上述生物标志物在CAG中的表达水平进行了相关研究，例如，XU 等[21]、FOX等[22]及文娜等[12]发现，TFF2在CAG组织中的表达水平明显升高，且其表达水平与胃癌前病变的病理严重程度密切相关。许辰等[14]探究了miR-181a的表达水平与CAG患者的病情及预后之间的关系，发现miR-181a在CAG组织中的表达水平上调，且其表达水平与患者肠化生等临床病理参数及预后相关。吴红艳等[23]发现CAG患者的RKIP表达水平降低，RKIP有望作为CAG的一种诊断指标。以上研究结果发现，TFF2、RKIP、miR-181a表达水平与CAG患者的病情关系密切,可作为预测胃癌发生、发展及判断预后的潜在生物标志物。本研究通过Logistic回归分析发现，年龄≥50岁、发病部位以胃窦为主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、饮食习惯不规律均为影响CAG发生的独立危险因素(P<0.05)，若患者具有以上因素中的任何一种，均需要对其加强随访，并予以积极治疗，这对促进患者康复并降低癌变风险意义重大。

综上所述，TFF2、RKIP和miR-181a表达水平在CAG患者的胃黏膜组织中升高，应对年龄≥50岁、发病部位以胃窦为主、有Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、饮食习惯不规律患者加强随访。