DHCR7基因在膀胱癌中的表达及其与临床特征及预后关系的生物信息学分析

赵 路，周 洋，黄君富，任章银

中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院检验科，重庆 400038

膀胱癌(BLCA)是泌尿系统的常见肿瘤，在世界范围内，膀胱癌的发病率在所有肿瘤中排名第十三位，在美国，男性膀胱癌的发病率居第四位，仅次于前列腺癌、肺癌、结直肠癌[1-2]。依据肿瘤的浸润程度，可将膀胱癌分为非肌层浸润型膀胱癌和肌层浸润型膀胱癌。初诊膀胱癌患者中，约90%的肿瘤类型为尿路上皮癌(其中约75%为非肌层浸润型，约25%为肌层浸润型)，其次为鳞状细胞癌，占3%～7%[3-5]。目前，膀胱癌的诊断主要依赖膀胱镜检查和病理组织活检，而治疗则依据肿瘤浸润程度、分期、分级、是否转移等情况选择膀胱肿瘤电切术或根治性全切术等不同的治疗方案。膀胱癌具有高度异质性的特点，不同分型的膀胱癌在术后化疗和预后方面存在明显差异，并且非肌层浸润型膀胱癌的5年复发率为60%～70%，其发病和复发的分子机制尚未阐明，这给膀胱癌的治疗及预后带来了极大挑战[6-8]。胆固醇是构成动物细胞膜的基本成分之一，参与维持细胞膜的完整性和流动性，同时，胆固醇也是胆汁酸、类固醇激素、维生素D的前体物质，因此，维持胆固醇的代谢稳态具有重要的生物学意义。近年来，研究发现胆固醇代谢参与调控了肿瘤相关信号通路、肿瘤微环境等，阻断胆固醇的合成、摄取可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[9-12]。靶向抑制胆固醇合成的他汀类药物可以通过多种机制抑制肿瘤的发生、发展[13]。7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)是参与胆固醇生物合成最后一步的酶类，是维持胆固醇合成和维生素D动态平衡的关键酶[14]，最新研究表明DHCR7可能参与了肿瘤的发生、发展过程。头颈部肿瘤中高表达的DHCR7与患者的不良预后有关，DHCR7基因的甲基化可能通过维生素D途径增加乳腺癌的患病风险[15-17]，这些研究表明，DHCR7有望成为新的肿瘤治疗靶点。为进一步探究DHCR7在肿瘤中的表达及临床意义，本研究以膀胱癌患者为研究对象，通过肿瘤有关数据库，应用生物信息学方法，探究DHCR7基因在膀胱癌中的表达及其与临床预后的关系，从肿瘤分子生物学角度为膀胱癌治疗靶点的选择及预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究通过Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库，检索“Bladder cancer”，设定筛选词：Series、Homo sapiens、Tissue、Expression profiling by array及Expression profiling by high throughput sequencing，筛选膀胱癌基因芯片或高通量测序数据组，选择GSE13507、GSE32548、GSE32894、GSE48276、GSE128959数据组进行研究。通过R(R4.0.5)软件，利用GEOquery、Devtools、AnnoProbe、GEOmirror等R包获取上述数据并进行标准化处理，获取基因表达矩阵及临床信息。通过The Cancer Genome Atlas(TCGA，https://www.cancer.gov/)数据库，设定限定词TCGA-BLCA、RNA-seq/FPKM，选择数据库中膀胱癌患者的RNA-seq数据及临床信息进行研究，同时应用Genotype-Tissue Expression(GTEx，https://www.genome.gov/)的表达数据与TCGA数据进行匹配分析。

1.2DHCR7基因表达分析 应用GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn)在线分析TCGA及GTEx数据库中正常膀胱组织与膀胱癌组织中DHCR7基因的表达差异；通过SPSS19.0、GraphPad Prism8.0软件分析上述TCGA、GEO数据库中DHCR7基因的表达及临床病理特征。

1.3生存分析 应用X-tile软件基于Kaplan Meier法对DHCR7表达量进行生存率评估，获取Cutpoints值，按照Cutpoints值将DHCR7表达水平分为高表达组与低表达组。通过GraphPad Prism8.0软件，应用Kaplan Meier法、Log-rank检验、单因素COX回归分析TCGA、GEO数据库中DHCR7基因表达水平与膀胱癌患者总生存期(OVS)、疾病特异性生存期(DSS)、无进展生存期(PFS)及无复发生存期(RFS)的关系。

1.4免疫组织化学法验证DHCR7在正常膀胱组织与膀胱癌组织中的表达差异 利用Human Protein Atlas(HPA，http://www.proteinatlas.org)数据库中免疫组织化学法检测数据，从蛋白水平验证DHCR7在正常膀胱组织及膀胱癌组织中的表达差异，所用抗体编号为HPA044280。

1.5蛋白质互作网络(PPI)及基因富集分析 通过GeneMANIA(http://genemania.org/)数据库，从基因共表达、基因融合、遗传相互作用、蛋白质同源性等方面构建PPI，通过GEPIA2在线分析上述基因与DHCR7基因在膀胱癌中的相关性；将TCGA中的样本数据，依据DHCR7的表达水平分为低表达组和高表达组，通过基因富集分析软件(GSEA 4.1.0)对DHCR7基因进行富集分析；选择MSigDB基因集为HallMark及KEGG基因集。

1.6统计学处理 采用R软件、SPSS19.0、GraphPad Prism8等进行原始数据处理及统计分析。采用t检验比较不同组织、分型的基因表达差异；采用Pearson相关分析法分析蛋白互作基因与DHCR7基因的相关性；采用Log-rank检验、单因素COX比例风险回归分析基因表达与患者生存的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DHCR7基因在正常膀胱组织及膀胱癌组织中的表达 通过对TCGA、GTEx数据库的分析，共获得28份正常膀胱组织及404份DHCR7基因表达的膀胱癌组织数据，膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平明显高于正常膀胱组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1；GSE13507的研究数据显示，膀胱癌组织中DHCR7的mRNA相对表达水平明显高于癌旁组织和正常膀胱组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：P为标线对应的两组间比较的统计参数。

注：P为标线对应的两组间比较的统计参数。

2.2DHCR7基因在不同分期、分级、病理分型膀胱癌组织中的表达差异 GSE13507、GSE32548、GSE32894的研究数据显示，Ta期与T1期、T2期的DHCR7基因mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；N0期与N1、N2期DHCR7基因mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；G1、G2、G3级DHCR7基因mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。GSE13507的研究数据显示，肌层浸润型、复发型膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平明显高于非肌层浸润型膀胱癌组织；GSE32894的研究数据显示，基于LUND 5分法的不同分子分型的膀胱癌组织中，DHCR7基因mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，基因未定型膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平均高于其他类型(P<0.05)。GSE128959中不同分子分型膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达情况与GSE32894中结果一致。见图3A～J。

注：P为标线对应的两组间比较的统计参数；A～G为GSE13507、GSE32548、GSE32894研究数据中不同分期、分级膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平的比较；H～J分别为不同分子分型的膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平的比较，NMIBC为非肌层浸润型膀胱癌，MIBC为肌层浸润型膀胱癌，Recurrent为复发型膀胱癌；Infiltrated为未筛选型，UroA为基底样细胞A型，SCC-like为鳞状细胞癌样型，UroB为基底样细胞B型，GU为基因未定型，Mes为间充质细胞型，Ba/Sq为基底/鳞状细胞型，UroA/B/C为尿路上皮型，ScNE为小细胞/神经内分泌型。

2.3DHCR7基因与膀胱癌患者预后生存的关系 TCGA的研究数据显示，DHCR7高表达组的OVS低于DHCR7低表达组，差异有统计学意义(HR=1.700，P=0.000 6)。GSE13507的研究数据显示，DHCR7高表达组的OVS明显低于DHCR7低表达组，差异有统计学意义(HR=2.850，P<0.000 1)，DHCR7高表达组与DHCR7低表达组的DSS、PFS比较，差异也有统计学意义(HR=3.611、P=0.000 3；HR=4.073、P=0.000 1)。GSE48276的研究数据显示，DHCR7高表达组的OVS明显低于DHCR7低表达组，差异有统计学意义(HR=2.300，P=0.044 2)。见图4A～F。

注：A 为TCGA数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组OVS比较；B为GSE13507数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组OVS比较；C为GSE13507数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组DSS比较；D为GSE13507数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组PFS比较；E为GSE13507数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组RFS比较；F为GSE48276数据分析中DHCR7高表达组与DHCR7低表达组OVS比较；HR为风险比；P为DHCR7高低表达组之间生存率比较的统计学参数。

2.4DHCR7蛋白在正常膀胱组织及膀胱癌组织中的表达差异 通过HPA数据库免疫组织化学法检测数据证实，DHCR7蛋白在正常膀胱组织中表达水平明显低于膀胱癌组织(P<0.05)。见图5A～C。

2.5DHCR7 PPI及基因相关性分析 通过GeneMANIA数据库，从基因共表达、基因融合、遗传相互作用、蛋白同源性、信号通路等方面构建PPI，其中与DHCR7基因相互作用的蛋白质有DHCR24、LBR、MVK、SREBF1、NFYC、SQLE、LSS、SC5D、TM7SF2、HMGCR、FDFT1、ACAT2、MSMO1、HMGCS1、TMEM97、FADS1、FDPS、NSDHL。膀胱癌TCGA数据库中DHCR7基因表达与部分互作基因的Pearson相关分析结果显示，DHCR7基因mRNA相对表达水平与SQLE(r=0.59，P<0.001)，HMGCR(r=0.54，P<0.001)，ACAT2(r=0.50，P<0.001)，HMGCS1(r=0.48，P<0.001)，MSMO1(r=0.48，P<0.001)、MVK(r=0.46，P<0.001)的表达呈正相关。

注：A为低分化膀胱癌组织；B为高分化膀胱癌组织；C为正常膀胱组织。

2.6GSEA基因富集分析 基因富集分析显示，膀胱癌组织中DHCR7基因高表达组主要富集的基因为胆固醇稳态基因、MTORC1通路基因、过氧化物酶体基因等，KEGG富集分析表明DHCR7基因高表达组富集的通路为类固醇合成、N-糖基合成、萜类化合物骨架合成等。

3 讨 论

膀胱癌是一种高侵袭性、高异质性的恶性肿瘤，其发生、发展是一个多因素参与、多步骤发展的复杂病理过程，发病机制尚未完全阐明。肌层浸润型膀胱癌与非肌层浸润型膀胱癌在诊断、治疗、预后与复发等多个方面有明显差异。非肌层浸润型膀胱癌预后相对较好，术后5年生存率达90%，但术后复发率高达70%；肌层浸润型膀胱癌恶性程度高、预后差，5年生存率在15%～60%[18]。基于膀胱癌高度异质性的特点，传统病理组织的分类方法已不能为临床诊断、治疗和预后评估提供准确指导，随着肿瘤分子生物学的发展，基于基因组学、表观遗传学、转录组学的膀胱癌分子分型逐渐得到认可。鉴于此，单个基因的生物信息学的研究有助于进一步明确膀胱癌异质性的机制和内在特征，完善膀胱癌分子分型方案，为临床诊断、治疗与预后评估提供理论依据。

DHCR7是参与胆固醇合成终末反应的酶类，其作用是将7-脱氢胆固醇(7-DHC)催化生成胆固醇，参与调控胆固醇与维生素D3的动态平衡[14]。研究发现胆固醇、维生素D3均参与了肿瘤的发生、发展过程[12,15-16,19-20]。参与胆固醇代谢的LDLR、SREBP、ACAT-1、LXR等又通过不同途径参与了肿瘤的演变过程[21-22]。干预LDLR受体，抑制胆固醇的摄取，可以抑制肿瘤细胞的增殖[23]。维生素D3及其相关代谢基因与甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌、食管鳞癌的患病风险有关，其中DHCR7的基因多态性通过调控维生素D的水平增加了甲状腺癌的患病风险，DHCR7的DNA异常甲基化通过维生素D途径增加了女性乳腺癌患病风险，但具体的机制仍需进一步阐明[16,22,24-25]。

本研究通过对TCGA、GEO数据库研究发现，膀胱癌中DHCR7基因mRNA相对表达水平明显高于癌旁组织及正常膀胱组织，肌层浸润型、复发型膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平明显高于非肌层浸润型膀胱癌组织。免疫组织化学法检测结果也证实，膀胱癌组织中DHCR7蛋白表达水平明显高于正常膀胱组织。不同肿瘤分期、分级的膀胱癌组织中DHCR7基因mRNA相对表达水平具有差异性，分期晚、分化程度低的膀胱癌组织中DHCR7的表达水平明显高于分期早、分化程度高的膀胱癌组织；此外，不同分子分型的膀胱癌组织中DHCR7基因的表达具有异质性，其中基因未定型膀胱癌组织中DHCR7基因的mRNA表达水平明显高于其他类型，以上资料均表明DHCR7基因促进了膀胱癌的发生、发展过程。生存分析结果显示：DHCR7基因表达水平与患者预后有关，DHCR7高表达组的OVS、PFS、DSS明显低于DHCR7低表达组，表明DHCR7高表达是患者预后不良的危险因素。为进一步阐明DHCR7在膀胱癌中可能的作用机制，通过构建PPI和共表达基因相关分析发现，DHCR7基因mRNA相对表达水平与SQLE、HMGCR、ACAT2、HMGCS1、MSMO1、MVK呈正相关。HMGCR、SQLE均为胆固醇合成中的关键限速酶，HMGCR在胃癌、前列腺癌、胶质瘤等多种肿瘤中存在过表达的现象，过表达的HMGCR可能分别通过Hedgehog/Gli1、Hippo通路促进胃癌细胞、胶质瘤细胞的增殖、迁移[26-28]。靶向抑制HMGCR的他汀类药物，可以通过抗血管生成、阻断细胞周期、抑制上皮间质化等途径发挥抗肿瘤的作用[13,29-30]，目前已被用于乳腺癌的临床治疗[31-32]。SQLE通过ERK、MYC、PI3K/AKT等多种通路参与肿瘤的形成[33-34]。MVK是甲羟戊酸途径合成胆固醇的关键酶。基于以上研究结果，笔者认为DHCR7可能通过协同HMGCR、SQLE、MVK干预胆固醇稳态，从而参与了膀胱癌的发生、发展。

本研究通过多个数据库研究资料，分析了DHCR7基因在膀胱癌与正常膀胱组织中的表达差异，发现了DHCR7基因与临床不良预后的关系，应用生物信息学方法初步探讨了DHCR7参与膀胱癌的可能机制，为膀胱癌的诊断分型及预后评估提供了理论支持。尽管本研究数据来源于数据库，缺少基础实验的数据支撑，存在一定的局限性，但仍为 DHCR7 基因在膀胱癌中的作用机制提供了新的研究方向和思路。