基于中医传承辅助平台与网络药理学探析中医治疗肺炎的组方配伍规律及作用机制*

杨皓博，周铭晗，范文涛

（陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046）

肺炎（pneumonia）是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、免疫损伤及药物等因素所致。其中细菌性肺炎和病毒性肺炎占了多数，肺炎患者通常表现为肺部湿啰音，呼吸急促，严重者可出现持续性高热、心悸、急性呼吸窘迫综合征[1]。中医学无“肺炎”病名，按照咳嗽、喘证辨证论治，常见证型有风寒束肺、风热犯肺、热毒炽盛、热毒壅肺等。本研究运用中医传承辅助平台对《中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂手册》中治疗肺炎的处方进行归纳、整理，分析配伍规律，筛选核心处方及核心药物，然后进一步采用网络药理学分析核心处方治疗肺炎的作用机制，旨在为临床治疗提供依据。

1 数据资料

1.1 处方来源与处方筛选 本研究使用中医传承辅助平台（V2.5）对《中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂手册》进行分析。《中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂手册》由中华人民共和国卫生部药典委员会于1993年编著，它规范了中成药的质量标准和主流中成药在临床使用标准[2]，且共收录了4 000余种中成药。在平台中的西医诊断中输入“肺炎”进行搜索，筛选出治疗肺炎的有效处方。

1.2 数据分析 通过软件平台中的“数据分析”模块，挖掘中医药治疗肺炎的用药规律。运用规则分析、频数规律等数据挖掘方法，即使用“复杂系统熵聚类”“组方规律”等功能，得到治疗肺炎的组方中各个药物之间的使用频数及药物的关联规则。

1.3 基于网络药理学的作用机制分析 通过药物频数统计、基于关联规则的组方规律筛选治疗肺炎的最佳处方，将所获得的中药输入TCMSP数据库，得出有效化合物成分及药物作用靶点，并且从GeneCards数据库中获取肺炎的疾病靶点基因，导入到R4.1.1数据包得到药物与疾病的靶点交集，输入Cytoscape 3.8.0软件绘制蛋白互作网络，并进一步进行网络拓扑分析。

1.4 靶点的通路分析 为了解所筛选出的蛋白基因的功能以及其在肺炎疾病信号通路中的作用机理，首先将所有靶基因名称通过Uniprot网站校正为其官方名称，将筛选得到的靶点导入R4.1.1数据包；然后通过输入所有靶标基因名称并将物种限制为人类，经上述数据库检索和转化操作，设定显著性程度P＜0.01；最后进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析将其分析结果进行可视化。

2 结果

2.1 证候统计 运用平台对肺炎进行中医证候分析并做统计。热毒炽盛证6次，痰热蕴肺证5次，热毒蕴肠证5次，风热犯肺4次，肺热壅盛4次，温毒犯表3次，热毒攻喉3次，风热犯表3次，风热壅盛2次，心血瘀阻2次。（见图1）

图1 证候频数图

2.2 药物性味归经分析 运用软件平台中“统计报表”系统模块中的“性味归经统计”功能。对筛选出的34首处方中药物所涉及的性味、归经进行统计。其中药性以寒、温为主，药味以苦、甘、辛为主。归经以肺经（109次）、胃经（80次）、心经（69次）、脾经（45次）为主。（见图2～4）

图2 药物四气频数图

图3 药物五味频数图

图4 药物归经频数图

2.3 用药频数分析 经分析得到可以治疗肺炎方剂有34首，共包含中药99味，用药频数在4次以上的共15味。排名前5味药分别是黄芩、石膏、甘草、金银花、苦杏仁。（见表1）

表1 用药频数≥4 的中药

2.4 药物关联规则分析 分析得到的34首处方之间的关联情况，使用网络化展示得出用药模式；选择“规则分析”选项，置信度选择0.8以上，所分析得到组合的药物组合关联规则见表2。

表2 药物组合关联规则

2.5 中药处方基于关联规则的组方规律 点击“组方规律”进行系统分析，并将支持度设置为5，置信度设置为0.6，根据药物组合的频数进行排列，共得到13种用药模式。（见表3）使用“新方聚类”功能得到10个核心组合。（见表4）

表3 常用药物用药模式

表4 用于熵聚类分析核心组合

2.6 核心处方及新方分析

2.6.1 核心处方分析 基于无监督的熵层次聚类分析，分别采用支持度为3、置信度为0.7，支持度为4、置信度为0.6，支持度为5、置信度为0.6，分析治疗肺炎的核心处方。最终获得治疗肺炎的核心组方为麻杏甘石汤加黄芩，进一步通过网络药理学分析麻杏甘石汤加黄芩治疗肺炎的作用机制，为临床应用提供依据。关联网络展示图见图5。

图5 不同支持度下关联规则网络化展示

2.6.2 新方分析 进一步将相关度设置12，惩罚度为2，筛出5个治疗肺炎的新处方。（见表5）

表5 基于熵层次聚类的新处方

2.7 所获取的核心药物的有效成分和作用靶点 支持度为5，置信度为0.6时可得到麻杏甘石汤加黄芩的治疗肺炎核心药物。将麻黄、苦杏仁、生石膏、甘草、黄芩输入TCMSP数据库，通过生物利用度（OB）＞30%及类药性（DL）＞0.18筛选得到麻黄23个有效成分，苦杏仁19个有效成分，甘草92个有效成分，黄芩36个有效成分，生石膏数据库均无有效成分和靶点记录在库，通过查找文献获得其有效成分，故统计出170个有效成分。麻杏甘石汤加黄芩中部分有效活性物基本信息见表6。

表6 麻杏甘石汤加黄芩中部分活性化合物基本信息

2.8 药物化合物作用靶点网络图 将所得出的有效化合物和靶点导入Cytoscape3.8.0并绘制网络图，得到包括有效化合物241个节点和1 025条边，每条边表示化合物分子与靶点之间的潜在作用关系。（见图6）

图6 麻杏甘石汤加黄芩潜在化合物-作用靶点网络图

2.9 蛋白互作分析和网络拓扑分析 将筛选得到的基因输入Cytoscape3.8.0中BisoGenet中绘制出蛋白互作网络（PPI），共得到2 980个节点，67 895条边。（见图7）使用CytoNCA插件对整体网络进行网络拓扑分析，还提出了度（degree）和介数（betweenness）等一系列可定量刻画网络内部结构的度量，选择DC模式，并选择最小值61筛选得到网络图，筛选后共得到680个节点，26 194条边。将所得到的网络图放大后选择BC模式，选择最小值600筛选得到网络图，筛选后共得到149个节点，3 636条边，最后放大得到图8。其中IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN及RELA等是麻杏甘石汤加黄芩主要活性成分的潜在靶点蛋白。

图7 麻杏甘石汤加黄芩蛋白质互作网络图

图8 麻杏甘石汤加黄芩治疗肺炎的网络拓扑分析图

2.10 高频药物的GO分析和KEGG分析

2.10.1 高频药物GO分析 通过使用R4.1.1数据包对所筛选出的基因列表进行GO富集分析功能，选取P＜0.01的20条通路得到气泡图。（见图9）分子功能中排名前3的分别是DNA结合转录因子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合。生物过程排名前3的分别是细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应和对类固醇激素反应。细胞成分排名前3的是膜筏、膜微区和富含ficolin-1颗粒腔。

图9 麻杏甘石汤加黄芩治疗肺炎的GO 富集分析

2.10.2 KEGG分析 通过KEGG通路富集筛选得到146条信号通路，故选取P＜0.01的20条通路。（见图10）这些基因在MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）及Jak-STAT信号通路（Jak-STAT signaling pathway）上富集的较多。（见图11～13）

图10 麻杏甘石汤加黄芩作用靶点KEGG 富集分析的20 条通路

图11 Jak-STAT 信号通路图

图12 p53 信号通路图

图13 MAPK 信号通路图

3 讨论

中医传承辅助平台结合了网络科学的方法和技术，可应用于总结名老中医的经验，总结特定疾病的用药规律，筛选用药频数最高的核心药物，从而指导新药研发并进行整理分析，有利于现代中医的创新传承[3]。中药是一种多靶点、多组分的药物，中药复方更是如此。网络药理学是生物信息学中十分重要的组成部分，是非常注重整体性和系统性的新兴学科[4]。网络药理学可对中药复方治疗疾病的机制及通路做出可视化分析，是进一步发展中医药产业的新方法[5]。

3.1 中医传承辅助平台组方配伍分析 本研究运用中医传承辅助平台对《中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂手册》中所记载的处方进行筛选，最终筛选出治疗肺炎的中药复方34首。治疗肺炎所应用的中药以寒性药、温性药为主，其中寒性药频数为115次（70.55%），温性药频数为25次（15.33%）。寒凉药多有清热、解毒、泻火的功效，在治疗肺炎里起到了清肃肺气的作用。温性药多有温中、散寒、助阳、补火等作用，在治疗肺炎中起到了温肺化饮的作用。筛选出的药物多归肺、胃、心、脾经。其味以苦、甘、辛味为主，其中苦味药频数为97次（40.58%），甘味药频数为69次（28.87%），辛味药频数为56次（23.43%），味苦以降肺气、味甘以补肺气、味辛以宣肺气[6]。热毒炽盛证出现6次，痰热蕴肺证5次，热毒蕴肠证5次，即肺炎的发生多与“热，毒，痰”有关。这与张利民等[7]关于肺炎证候研究的结果基本一致。麻杏甘石汤主治邪热壅肺证，而黄芩能清热燥湿，解气分之热，清上焦实热，即解热毒炽盛之热[8]。

药物频数分析显示，最常使用的中药中前5味药分别是黄芩（15次），石膏（9次），甘草（8次），金银花（8次），苦杏仁（8次）。黄芩味苦，性寒，能清上焦之火，燥湿解毒。黄芩是《活人方》中所著清金丸的君药[9]，其主治肺金枯燥，气逆喘嗽，脏腑实火内炽与现今肺炎疾病类似。研究表明，黄芩苷可用于治疗肺炎、肿瘤及肝炎等疾病[10]。苦杏仁性微温，味苦，归肺经、大肠经。其主要用于治疗肺气上逆、反复咳喘不愈、大便干结。苦杏仁为止咳平喘要药。苦杏仁的甲醇提取物苦杏仁苷可以通过分解成氢氰酸发挥镇咳、平喘、抑制呼吸中枢的作用，从而治疗肺炎[11]。甘草甘，平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳的功效。甘草中甘草酸的抗病毒作用较强，对肺炎有一定治疗作用。杨晓露等[12]的研究证实了甘草总黄酮能有效抑制细胞上清中一氧化氮（NO）产物亚硝酸盐含量，下调激活巨噬细胞中iNOS、COX-2的水平，抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）中的细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，上调PPAR-γmRNA的表达，从而达到抗炎效果[13]。金银花味甘性寒，归肺、胃经，主清热解毒。金银花具有抗炎、清热、抗病毒等多重药理作用。金银花水提液及金银花醇对流感病毒有明显抑制作用[14]。石膏味甘、辛，性大寒，归肺、胃经，主清热泻火、除烦止渴。现代药理研究[15]表明生石膏中富含Ca2+，可以通过抑制神经肌肉的兴奋性和调节血管通透性，来达到解痉及抗炎的作用，并且还对体温调节中心有抑制作用，可以解热而不出汗。麻黄性温，味辛、微苦，归肺、膀胱经。麻黄的水煎剂、水提物和挥发油均有很好的解热、平喘、镇咳，抗炎等作用，麻黄中所含的麻黄碱、伪麻黄碱可以通过兴奋支气管平滑肌的β受体来松弛平滑肌，并兴奋黏膜血管平滑肌α受体来收缩血管，以达到平喘的目的[16]。

本研究筛选出的核心处方为麻杏甘石汤加黄芩。麻杏甘石汤首出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治法》[17]，后世医家多将其用于风寒化热，或风热犯肺，或见肺中热盛，身热喘咳，口渴脉数等证的治疗。麻杏甘石汤具有清凉解表、清肺平喘的功效，是治疗肺炎的常用方剂。

3.2 网络药理学分析核心处方的作用机制 麻杏甘石汤加黄芩化合物成分、靶标基因与疾病靶点之间具有50个交集靶点，中心靶点为IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN以及RELA。IL-6具有多种生物学功能，是急性时相反应的有效诱导剂。IL-6在B细胞最终分化为参与淋巴细胞与单核细胞分化的免疫球蛋白分泌细胞中起重要作用[18]。同时IL-6也是肺炎诊疗方案临床的重要指标[19]，对肺炎的治疗起重要作用。这些靶点可能是麻杏甘石汤加黄芩治疗肺炎的关键靶点及作用机制之一。GO富集分析结果显示，麻杏甘石汤加黄芩可能通过影响与DNA结合转录因子结合的蛋白质，与基因调控区内的特定DNA序列相互作用以调节转录，通过调节特定DNA序列的转录表达达到防治肺炎的目的。KEGG通路富集分析筛选得到了MAPK信号通路、p53信号通路及Jak-STAT信号通路等信号通路。其中MAPK通过激活NF-κB的活性，可以使促炎性细胞因子大量释放，还可通过JNK激活c-Jun来控制细胞凋亡[20]。p53信号通路由多种应激信号诱导，能使PKB/Akt通过去磷酸化激活NF-κB的活性，通过DNA调节COX-2活性来促进血管生成[21]。Jak-STAT信号通路可以通过与MAPK信号通路的级联反应，进一步介导炎症和免疫调节等作用[22]。这些作用靶点与通路相互影响，可能是麻杏甘石汤加黄芩治疗肺炎的可能作用机制之一，其具体作用机制有待继续探讨。