万寿菊中叶黄素的皂化工艺研究

吴红艳，杨宝茹，李秀鑫，仲伟健，代明朗

(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

叶黄素是存在于蔬菜、水果、植物和花卉中的一种类胡萝卜素，在万寿菊花瓣中含量极为丰富[1]。叶黄素作为一种色彩艳丽且着色能力很强的天然黄色素，还具有保护视网膜、防止紫外线损伤皮肤、调节机体免疫力、预防癌症等多种生理功能。同时，叶黄素无毒害、安全系数高，并且有良好的抗氧化活性，因此其具有较高的营养价值[2-3]。我国早在食品安全标准GB 26405-2011中规定，允许叶黄素作为食品添加剂[4]。叶黄素在食品的色泽、风味、营养价值等方面作出很大贡献，可作为一种功能性的调味品。高纯度的叶黄素在医药保健、食品、调味品、饲料添加剂、化妆品等领域具有较高的开发价值和广阔的应用前景[5-7]。

随着现阶段对叶黄素功能特性的不断研究，叶黄素类高端产品引起越来越多消费者的关注，具有良好的市场前景，因此制备高纯度的叶黄素成为研究的必然趋势[8-12]。游离态叶黄素和叶黄素酯是叶黄素存在于万寿菊中的两种形式[13]，在万寿菊中大多以叶黄素酯的形式存在，游离叶黄素含量很少，若要制备高纯度的叶黄素可以对叶黄素酯进行皂化[14]。本研究选用万寿菊颗粒为原料，采用微乳液提取法，得到叶黄素酯，对叶黄素酯进行皂化，得到游离态的叶黄素粗产品，后续可采用柱层析结晶等方法进一步纯化[15]。本研究对皂化工艺条件进行优化，为制备出高纯度的食品级叶黄素奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

万寿菊颗粒：广州立达尔生物科技股份有限公司；叶黄素标准品(纯度≥90%)：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试剂

氢氧化钾(国产分析纯)：沈阳金泰尔化工有限公司；氢氧化钠(国产分析纯)：伊维特(辽宁)化工有限公司；无水乙醇(国产分析纯)：天津市光复精细化工有限公司；甲醇、乙酸乙酯(均为色谱纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

Sartorius普及型pH计 德国赛多利斯公司；722N型可见分光光度计 冠森生物科技(上海)有限公司；BSA124S-CW型分析天平 北京海天友诚科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵 上海力辰仪器科技有限公司；DL-360E型智能超声波清洗器 上海之信仪器有限公司；Z233 MK-2型离心机 德国HERMLE公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHA-C型恒温水浴振荡器 济南欧莱博科学仪器有限公司；HPLC-1260型高效液相色谱仪 北京京科瑞达科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 叶黄素酯的制备

将万寿菊颗粒粉碎并过80目筛，将万寿菊粉与葵花籽油微乳液按1∶50的比例进行均匀混合，加入1%的纤维素酶，混合均匀。将其置于45 ℃的恒温水浴振荡器中振荡2.0 h，随后用0.45 μm的滤膜抽滤处理，收集滤液，将滤液进行旋转蒸发浓缩，得到叶黄素酯。

1.4.2 皂化剂的选取

准确称取10.0 g叶黄素酯，溶解于40 mL无水乙醇中，分别加入10 mL 0.1 g/mL不同的皂化剂。在50 ℃下进行超声处理，皂化50 min，然后进行抽滤，取上清液，测量在447 nm处的吸光度值。

1.4.3 叶黄素皂化工艺的单因素试验

准确称取10.0 g叶黄素酯，溶解于40 mL无水乙醇中，量取10 mL于50 mL离心管中，以碱液浓度、皂化时间、皂化温度为考察因素，按照表1方案设计进行单因素试验，然后进行抽滤，取上清液，在447 nm处测量吸光度值。

表1 单因素试验

1.4.4 响应面优化试验

采用3个因素进行优化设计，分别为A时间(min)、B温度(℃)和C碱液浓度(g/mL)，建立响应模型进行优化。响应面试验因素及水平见表2。

表2 响应面试验因素及水平表

1.4.5 叶黄素含量的测定

准确称取1 mg叶黄素，将其完全溶解在10 mL甲醇中并稀释，制成0.1 mg/mL的标准溶液。C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，进样量为1 μL，流速为0.5 mL/min，流动相为乙酸乙酯。

1.4.6 数据分析

每个试验重复3次，数据用Origin 8.0绘图，用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行显著性分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 皂化剂的选择

将叶黄素酯分别与不同皂化剂进行皂化反应，固定温度为50 ℃，超声皂化50 min，然后抽滤，测量所得滤液在波长447 nm处的吸光度值，结果见图1。

图1 不同皂化剂对叶黄素酯皂化的影响

由图1可知，以氢氧化钾-乙醇溶液为皂化剂进行反应后得到的叶黄素的吸光度值最高，由于KOH比NaOH的碱性强，所以能够更顺利地进行皂化工艺，故皂化后的叶黄素溶液的吸光度值较高，另外，碱的乙醇溶液均比其水溶液的吸光度值高，是因为乙醇能够使叶黄素酯更好地溶解，使其得到了充分的分离，其与反应物之间的接触面积增加，从而导致反应速率加快，皂化效果更明显。因此，该试验使用氢氧化钾-乙醇溶液作为皂化剂。

2.2 碱液浓度对叶黄素酯皂化的影响

将叶黄素酯在温度为50 ℃、时间为50 min的条件下，以氢氧化钾-乙醇溶液为皂化剂，分别用不同浓度的碱液进行超声皂化反应，然后抽滤，测量所得滤液在波长447 nm处的吸光度值，结果见图2。

图2 碱液浓度对叶黄素酯皂化的影响

由图2可知，开始阶段吸光度值随着碱液浓度的增加而增大，碱液浓度为0.15 g/mL时吸光度值最大，为6.087，说明此时的皂化比较充分；碱液浓度高于0.15 g/mL时，叶黄素的稳定性可能会受到高碱浓度和高pH值的影响，吸光度值下降[16]。另外，过量的氢氧化钾不仅对叶黄素有不利影响，也会使溶液中的杂质增加，对吸光度和试验效果都有一定的影响。因此，本试验选取0.15 g/mL为最佳皂化碱液浓度。

2.3 皂化时间对叶黄素酯皂化的影响

在氢氧化钾-乙醇溶液浓度为0.15 g/mL、温度为50 ℃的条件下，将叶黄素酯分别按不同时间进行超声皂化处理，然后抽滤，测量所得滤液在波长447 nm处的吸光度值，结果见图3。

图3 时间对叶黄素酯皂化的影响

由图3可知，开始阶段溶液的吸光度值随着时间的延长而增大，皂化时间为50 min时吸光度值最大，为6.437，此时的皂化效果较好。但是皂化时间超过50 min后，可能由于叶黄素的稳定性差，时间过长而被氧化，因而吸光度值开始逐渐下降[17]。因此，本试验选取最佳皂化时间为50 min。

2.4 皂化温度对叶黄素酯皂化的影响

在氢氧化钾-乙醇溶液浓度为0.15 g/mL、时间为50 min的条件下，在不同温度条件下将叶黄素酯进行超声皂化，然后抽滤，在447 nm处测量滤液的吸光度值，结果见图4。

图4 温度对叶黄素酯皂化的影响

由图4可知，开始阶段溶液的吸光度值随着皂化温度的升高而增大，皂化温度为50 ℃时吸光度值最大，为5.887，此时的皂化效果较好。皂化温度高于50 ℃时，温度过高可能会对叶黄素的稳定性造成一定影响，导致吸光度值下降[18]，温度过高影响皂化反应的顺利进行，从而对吸光度值也造成一定的影响。因此，本试验选取最佳皂化温度为50 ℃。

2.5 响应面分析

2.5.1 响应面优化试验结果分析

基于单因素试验3个变量因素：A时间(min)、B温度(℃)、C碱液浓度(g/mL)，利用响应面分析优化皂化条件，得出最佳的皂化条件。设计了17组试验数据进行响应面分析(见表3)，回归模型系数的检验结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果

表4 回归模型系数的检验结果

2.5.2 模型建立及分析评价

对表4中的试验数据进行二项式回归拟合，吸光度值(Y)对时间(A)、温度(B)和碱液浓度(C)的二次多项式回归方程为：

Y=6.01+0.032A+3.625E-003B+0.027C+1.000E-0003AB+0.033AC-2.500E-0.004BC-0.030A2-0.0854B2-0.058C2。

F检验表示回归方程中每个变量对响应值的影响显著性。概率“Pr>F”的值越小，相应变量越显著。由表4可知，模型的“Pr>F”概率为0.0031<0.01，说明模型对响应值Y的影响极显著；该模型的单因素中，A(时间)、C(碱液浓度)对响应值Y的影响显著，B(温度)对响应值Y的影响不显著；在交互作用中，对响应值Y的影响均不显著；在模型的二次项中，B2、C2对响应值Y的影响极显著，A2对响应值Y的影响不显著。各因素对叶黄素提取率的影响大小依次为时间>碱液浓度>温度。模型失拟项的“Pr> F”为0.2177，影响不显著，可以应用于模型分析和预测叶黄素酯皂化工艺研究。

由表4可知，预测系数为0.8266，且校正系数为0.8351，预测系数的拟合度高。决定系数为0.9279，可以用于模型分析。该测试模型的信噪比为8.244>4，因此该模型可用于实际试验分析。

2.5.3 各因素的响应面图谱

在回归模型方差分析的基础上，使用响应曲面图对回归模型进行分析，以进一步检验相关因素之间的相互作用及其最大优势，见图5～图7。

图5 因素A和因素B相互作用的等高线图和响应面图

图6 因素A和因素C相互作用的等高线图和响应面图

图7 因素B和因素C相互作用的等高线图和响应面图

由图5～图7可知，响应值Y与每个因素都具有抛物线关系，并且随着各因素值的变化，响应值Y也发生变化，先增大到最大值然后减小。因此，叶黄素酯皂化时，只有在一定的条件下，吸光度值才会达到最高。

根据Design Expert软件的优化得到最佳条件为时间57 min、温度50 ℃、碱液浓度0.17 g/mL。在此条件下吸光度理论值为6.029，将数据代入SAS软件进行分析来验证优化的结果。经过分析后，与获得的最佳条件结果一致。

2.6 叶黄素标准品的标准曲线

配制等梯度浓度的叶黄素乙醇标准品进行高效液相分析试验，求出峰面积。以峰面积为纵坐标，以叶黄素浓度为横坐标绘制标准曲线，见图8。

图8 叶黄素标准品-乙醇HPLC图的标准曲线

2.7 验证试验

采用Design Expert软件优化的最佳提取条件皂化叶黄素酯，即在50 ℃和碱液浓度为0.17 g/mL的条件下皂化57 min，平行3次取其平均值。结果表明，在最佳萃取条件下的实际吸光度为6.027，纯度可达到48.21%，与预测的理论值相似，表明该模型可以实际反映并筛选出最佳条件。

3 结论

本研究主要对万寿菊颗粒中的叶黄素酯进行皂化。研究结论：采用4种不同皂化剂对叶黄素酯进行皂化试验，结果表明氢氧化钾-乙醇溶液对叶黄素酯皂化的效果比较好，得出其最佳的皂化条件为时间50 min、温度50 ℃、碱液浓度0.15 g/mL。响应面数据分析表明，时间和碱液浓度对吸光度值的影响极显著，而温度不显著。优化后的最佳皂化条件：时间为57 min，温度为50 ℃，碱液浓度为0.17 g/mL。在此条件下测得吸光度理论值为6.029，叶黄素纯度可达48.21%。叶黄素可以改善食品的风味和色泽，并且具有良好的生理功效，被广泛应用于食品、医疗、饲料添加剂及保健品行业中，具有较高的商业价值。因此，本研究对万寿菊中叶黄素的皂化工艺条件进行了优化，为叶黄素的纯化试验提供了可靠的科学基础，提高了叶黄素纯化的前期制备效率，为获取高纯度的食品级叶黄素提供了简单高效的技术工艺。