不同取样方式对臭鳜鱼细菌多样性分析的影响

钱晓庆，张楠，李佳鹏，冯悦虎，张玉*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 发酵工程教育部重点实验室，武汉 430068；2.工业发酵省部共建协同创新中心，武汉 430068；3.工业微生物湖北省重点实验室，武汉 430068；4.武汉和平生物环保有限公司，武汉 430068)

高通量测序技术是一种在较短的时间内对数千至数亿条核酸分子进行序列检测，快速分析出待测样本中群落结构及多样性的新技术。此前，研究微生物多样性的方法主要包括传统分离培养法[1]、变性梯度、温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)法等。然而这些方法都存在局限性，如传统分离培养法无法将样品中的微生物全部分离，且时间成本高[2]；变性梯度、温度梯度凝胶电泳法的分辨率较低[3]。而高通量测序技术能够检测出存活率低和能存活但不可培养的微生物，使得待测样本的微生物群落信息更为全面有效，在环境[4]、医学[5]、发酵食品[6-8]等领域都有广泛应用。

臭鳜鱼是一种将新鲜鳜鱼经盐腌、短期自然发酵而成的发酵水产品，风味独特、味道鲜美，广受消费者喜爱。现有研究表明，臭鳜鱼特征风味的形成与发酵过程中微生物多样性息息相关。Yang等[9]取鳜鱼发酵后期的发酵液用于16S rRNA测序，发现了发酵后期Psychrilyobacter、梭杆菌属、弓杆菌属(Arcobacter)和Oceanisphaera等微生物通过影响蛋白质水解促进臭鳜鱼风味物质的形成和释放，改善了产品的整体风味和香气。柯泽华[10]采用鱼肉组织取样，微生物多样性分析结果表明乳杆菌、乳球菌等是臭鳜鱼风味的主要贡献者。Wang等[11]对比研究了臭鳜鱼背部肉样和腹部肉样，其微生物多样性和风味存在显著差异。目前，不同取样方法(渗出液、鱼体外表面擦拭物及鱼肉组织)对臭鳜鱼微生物多样性的影响尚未见报道。

本研究采用3种取样方式(渗出液、鱼体外表面擦拭物和鱼肉组织)对臭鳜鱼样本进行取样，利用高通量测序技术对取得的样品进行细菌多样性分析，明确了不同取样方式下臭鳜鱼样品的优势菌群及差异。本研究结果可为分析发酵产品微生物多样性在选择取样方式方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

臭鳜鱼(500±50) g购于安徽老徽乡食品有限公司，带制冷剂运输至实验室，贮藏于-18 ℃冰箱中备用。

1.2 试剂

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒:美国Omega公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒:美国Axygen Biosciences公司；氯化钠(分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

JE2002G型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；YLY-100BU型超纯水机 深圳市亿利源水处理设备有限公司；SCI-VS型旋涡混匀仪 北京海天友诚科技有限公司；DSX-24L型手提式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；BCM-1000型超净工作台 苏州净化设备有限公司；Himac CF16RN型多功能离心机 日立(中国)有限公司；BCD-520WDPD型冰箱 海尔智家股份有限公司；DW-86L828W型海尔超低温冰箱 青岛海尔生物医疗股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微生物取样

渗出液样品的取样：将带包装的臭鳜鱼置于4 ℃冰箱中至完全解冻，在无菌超净工作台上打开包装，取内包装袋渗出液5 mL于无菌离心管中，12000 r/min离心10 min，弃去上清液，所得沉淀为臭鳜鱼渗出液样品(以下简写为J样品)。

鱼体外表面擦拭物样品的取样：在无菌超净工作台上将上述臭鳜鱼从内包装袋中取出，用润湿无菌生理盐水的无菌棉签擦拭鱼体外表面，得鱼体外表面擦拭物样品(以下简写为W样品)。

鱼肉样品的取样：在无菌超净工作台上，将上述臭鳜鱼去皮后，取5.0 g背部鱼肉组织并剪碎于无菌离心管中，加入50 mL无菌生理盐水，涡旋混匀10 min。弃去大块鱼肉后以12000 r/min离心10 min，所得沉淀为鱼肉样品(以下简写为R样品)。

1.4.2 DNA提取和PCR扩增

按照细菌DNA试剂盒使用说明书提取细菌DNA，并用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检查DNA的提取纯度和浓度[12]，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作为引物对细菌的16S rDNA基因V3～V4区域[13]进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并用DNA荧光定量系统对PCR产物进行检测定量。

1.4.3 微生物样本高通量测序和数据分析

将所得微生物样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq技术测序平台进行高通量测序，测序结果使用该公司的生信云平台(https://cloud.majorbio.com/)对数据进行分析处理。使用Usearch(5.2.236)、Uchime(4.2.40)去除非特异性扩增序列及嵌合体。将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，然后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元(OTU)。通常对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。

2 结果与分析

2.1 细菌群落的α多样性分析

采用3种取样方式对臭鳜鱼进行测序分析，分别得到44411，42852，63678条有效序列。由图1可知，基于细菌OTU数的各样品稀释曲线随着测序深度的增加逐渐趋于平缓，不同取样方式样品中微生物的Coverage指数都为0.99(见表1)，表明测序数据量充分，测序结果能够真实反映3种样品细菌的物种信息。

图1 3种样品细菌Shannon指数稀释曲线

表1 3种样品中细菌的α多样性分析

可以通过分析α多样性来评估微生物物种的丰富度和多样性。Chao1指数和Ace指数描述了不同样品中微生物群落的丰富度，其数值越大，微生物群落丰富度越高；Simpson指数与Shannon指数描述了不同样品中微生物群落的多样性，Shannon指数越大，Simpson指数越小，则微生物多样性越高；Coverage指数用来反映样品微生物群落覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高[14-16]。

由表1可知，臭鳜鱼样品的Chao1指数和Ace指数最大，说明鱼肉样品中细菌丰度最高，这可能是因为臭鳜鱼发酵完成后立即包装并进行速冻，此时所有微生物主要集中在鱼肉部分及部分附着在鱼体表面。渗出液样品的Shannon指数和Simpson指数分别为最高和最低，说明渗出液样品中细菌多样性更加丰富，这可能是由于在-18 ℃贮藏期间，部分嗜冷菌在鱼体表面缓慢生长；而且在解冻时，鱼体内部微生物随渗出液扩散至鱼体外部；此外，样本解冻时间较长，中心温度从-18 ℃逐渐升高，鱼体外表面温度一直处于4 ℃，且包装袋内留存有一定量的氧气，部分微生物在此环境下开始生长。因而渗出液样品中细菌多样性比鱼肉样品和鱼体外表面擦拭物样品中细菌多样性高。

OTU样本分布韦恩图见图2，3种取样方式样品的OTUs共有数为56，渗出液样品、鱼肉样品和鱼体外表面擦拭物样品的OTUs独有数分别为7，4，1。与其他两种取样方式相比，渗出液样品中细菌OTUs独有数最大，与其微生物多样性最高的结果一致。

图2 3种样品细菌韦恩图分析

2.2 基于门水平的细菌群落结构分析

由图3可知，在门分类水平上，3种样品的细菌相对丰度>1%的共有菌门为5个，分别为厚壁菌门(Firmicutes，58.28%、11.04%、20.25%)、梭杆菌门(Fusobacteriota，23.40%、68.69%、62.03%)、变形菌门(Proteobacteria，7.78%、6.58%、2.39%)、拟杆菌门(Bacteroidota，5.34%、8.09%、9.44%)和螺旋体门(Spirochaetota，2.25%、4.91%、4.94%)。鱼肉样品和鱼体外表面擦拭物样品主要菌门一致，但在相对丰度上存在差异。此外，渗出液样品中细菌相对丰度>1%的还有放线菌门(Actinobacteriota，2.86%)，这是因为渗出液样品中氧气含量相对较高，而放线菌大多数为好氧菌，因而能更好地生长繁殖。

图3 门水平上3种样品的细菌丰度分析

2.3 基于属水平的细菌群落结构分析

3种样品在属水平上细菌菌属的总体概况见图4，3种样品中共有的菌属主要为Psychrilyobacter(14.24%、46.44%、32.80%)、梭杆菌属(Fusobacterium，9.15%、22.25%、29.24%)、乳杆菌属(Lactobacillus，31.65%、7.19%、11.60%)、漫游球菌属(Vagococcus，17.70%、2.14%、6.62%)、拟杆菌属(Bacteroides，5.33%、8.08%、9.44%)、球藻菌属(Sphaerochaeta，2.25%、4.91%、4.94%)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter，7.13%、1.25%、1.31%)、肉食杆菌属(Carnobacterium，6.97%、0.43%、0.80%)等。渗出液样品中乳杆菌属和漫游球菌属的优势较为明显；鱼肉样品与鱼肉外表面擦拭物样品中优势菌属一致，为Psychrilyobacter和梭杆菌属。

图4 属水平上的3种样品的细菌丰度分析

3个样品在属水平上的差异来源于微生物的生长特异性，乳杆菌是革兰氏阳性菌，兼性厌氧，有时微好氧，广泛存在于发酵食品的微生物群落中[17-18]。漫游球菌属能够进行发酵代谢，利用一些碳水化合物产生乳酸，能合成蛋白酶、碳水化合物活性酶等，促进蛋白质、碳水化合物的分解[19]。乳杆菌属和漫游球菌属能够加速乳酸积累，降低pH值，抑制其他微生物的生长，因而在渗出液样品中具有较高的丰度。此外，乳杆菌也能够产香味化合物，提高臭鳜鱼特征风味化合物含量[20]；Psychrilyobacter能够加速蛋白质水解，释放游离氨基酸，梭杆菌属是革兰氏阳性菌，专性厌氧，Psychrilyobacter和梭杆菌属在鱼肉样品中均具有较高的丰度，这可能是因为二者都能利用鱼肉中丰富的营养物质进行生长繁殖。此外，Psychrilyobacter和梭菌属是鳜鱼发酵后期的优势微生物，与芳樟醇、乙酸香叶酯、顺式香芹醇、吲哚等特征香气有关。拟杆菌属(Bacteroides)是革兰氏阴性厌氧菌，因此在鱼肉样品和表面样品中相对丰度较高，在渗出液样品中相对丰度低；肉食杆菌属在渗出液样品中相对丰度最高，该菌可产生2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等挥发性物质，是鲑鱼、虾等水产品中的主要腐败菌[21-22]；弧菌属在鱼肉样品中相对丰度较高，可能是由于弧菌具有较强的蛋白质分解能力，能够利用鱼肉中丰富的蛋白质进行生长繁殖，也是水产品的特定腐败菌[23]。

由于不同菌属对氧气的需求量和营养物质的利用程度不同，因此在渗出液样品、鱼体外表面擦拭物样品和鱼肉样品中检测出的优势菌属相对丰度有所差异。3种样品中优势菌属对鳜鱼的发酵均具有重要意义，取样方式不同，微生物多样性存在差异，对后续臭鳜鱼风味化合物与其微生物的关联分析造成影响。

2.4 基于属水平的主成分分析

由图5可知，第一主成分的贡献率为83.70%，第二主成分的贡献率为16.31%，累计贡献率约为100%。3种样品分布于不同区域，渗出液样品位于PC1的负端区域及PC2的正端区域；鱼肉样品主要分布于PC1的正端区域及PC2的负端区域；鱼肉外表面擦拭物样品主要分布于PC1的正端区域及PC2的正端区域附近。将3种取样方式样品向PC1轴投影，鱼肉样品和鱼肉外表面擦拭物样品均位于PC1轴右侧，且两者较为接近，而渗出液样品位于PC1轴左侧，远离鱼肉样品和鱼肉外表面擦拭物样品位置。由于PC1的贡献率为83.70%，能够概括绝大部分的样品信息，因此鱼肉样品和鱼肉外表面擦拭物样品细菌群落结构相似，与渗出液样品细菌群落结构差异较大。

图5 基于属水平的3种样品细菌群落结构主成分分析

3 结论

本研究运用高通量测序技术分析了不同取样方式对臭鳜鱼细菌多样性的影响。结果表明，鱼肉样品和鱼体外表面擦拭物样品中细菌多样性相似，而与渗出液样品中细菌多样性存在差异。鱼肉样品的细菌丰度最高，说明微生物在营养丰富的鱼肉中进行厌氧或兼性厌氧生长繁殖，鱼肉样品中Psychrilyobacter和梭杆菌属为主要菌属。渗出液样品中的微生物多样性最高，这可能与产品包装时环境情况和人为操作有关，渗出液样品中乳杆菌属和漫游球菌属为主要菌属。综合主成分和物种丰度聚类热图分析，鱼肉样品和鱼体外表面擦拭物样品细菌群落结构较为相似，与渗出液样品细菌群落结构差异较大。因此在取样过程中，可根据实际情况进行选择。若要保证产品无损，则可选择鱼体外表面擦拭物取样，方便快捷；若样本为成品发酵鱼，则可选择鱼肉取样，可得到数量更为丰富的微生物；若样本为发酵过程中的鱼产品，则可选择发酵液和鱼肉取样，可得到更为全面的微生物多样性信息，且有助于从中分离得到发酵产品风味化合物形成的核心菌株。