产香兰素内生真菌GP20的鉴定及发酵条件研究

闫佳佳，万璐，尤梦瑶，曾伟民*，郑春英*

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 生命科学学院 黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080)

香兰素(vanillin)又名香兰醛、香草醛，化学结构见图1[1]，素有“食品香料之王”的美称，是世界上使用最广泛的调味料之一[2]。香兰素不仅因其独特浓郁的香草味作为调味品在食品中起到助香、增味的作用[3]，而且因其具有抗菌[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抗炎[7]等活性，在药品、化妆品、农业等领域被广泛应用[8]。

图1 香兰素化学结构

关于香兰素的生产，主要有3种方法[9]：一是直接从香草兰荚果中提取分离，但该法原料供应受限，生产周期长，价格昂贵；二是化学合成法，但合成的香兰素纯度及得率较低，且生产工艺为非环境友好型；三是微生物转化法，利用天然底物阿魏酸等，经微生物转化成香兰素。采用微生物转化法所生产的香兰素通常被称为“天然香兰素”，其品质优于化学合成的香兰素，是非常有发展前景的研究热点，采用微生物转化法生产香兰素的关键在于微生物菌株的筛选及工艺的优化，本文以分离自北五味子根部的内生真菌GP20为研究对象，该菌株具有浓郁宜人的奶香气味，为探讨其产香风味物质，对其进行次生代谢产物及抑菌活性研究，并对其发酵工艺进行优化；同时，对其进行菌种鉴定，以便为采用微生物发酵法生产调味香料香兰素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌为内生真菌GP20，分离自黑龙江省尚志市野生五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)根部；NA、PDA培养基的配制方法参考文献[10-11]；受试菌共11株，购于黑龙江省微生物研究所；ITS序列通用引物ITS1、ITS4，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；除液相用甲醇为色谱纯级别外，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FL2200型高效液相色谱仪 浙江温岭福立分析仪器有限公司；HZQ-C型空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 发酵液供试品的制备

无菌条件下，取五味子内生真菌GP20，挑取适量接种于50 mL PDA培养基中，置于空气浴摇床中(28 ℃，140 r/min)培养24 h，制成 1×107CFU/mL种子液；量取GP20种子液，以10%(体积比)接种至装液量为200 mLPDA培养基中后，置于空气浴摇床中培养7 d(28 ℃，140 r/min)，终止发酵，离心(4500 r/min，10 min)，取上清液，醇沉(加入无水乙醇使含醇量为75%)，以除去发酵液中的多糖，抽滤，滤液作为发酵液供试品备用。

1.3.2 内生真菌GP20发酵液活性成分分析

内生真菌GP20发酵液活性成分分析采用HPLC法。

HPLC检测条件：Venusil XBP C18柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm); 流动相：甲醇∶水∶甲酸为25∶74∶1；流速1 mL/min;柱温：室温；检测波长254 nm。

1.3.2.1 供试品液的制备

取10 mL“1.3.1”发酵液供试品，减压回收液体挥发至干燥(50 ℃，0.1 MPa)，加1 mL甲醇溶解后，过滤(0.22 μm微孔滤膜过滤)，取滤液作为供试品溶液。

1.3.2.2 对照品液的制备

精密称取香兰素对照品适量，加甲醇溶解后，作为0.5 mg/mL的对照品溶液备用。

1.3.2.3 空白对照品液的制备

取PDA培养基10 mL，同“1.3.2.1”法制成空白对照品液。

HPLC分析：分别取供试品液、对照品液及空白对照品液各10 μL注入 HPLC 仪器。

1.3.3 内生真菌GP20抑菌活性分析

分别以100 μg/mL链霉素和制霉素作为阳性对照，以甲醇溶液为空白对照，参考文献[12]，采用琼脂扩散法对内生真菌GP20发酵液进行抗菌活性分析。

1.3.4 内生真菌GP20发酵条件优选

1.3.4.1 单因素实验

a.接种量对抑菌活性的影响

取“1.3.1”种子液分别依次按1%、5%、10%、15%、20%(体积比)的比例接种到装有200 mL初始pH值为7.0的PDA培养基中，发酵培养7 d(28 ℃，140 r/min)，按“1.3.3”测定发酵液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌活性(n=3)。

b.装液量对抑菌活性的影响

将“1.3.1”种子液以10%(体积比)的接种量分别接入到装有100，150，200，250，300，350 mL初始pH值为7.0的PDA培养基中，发酵培养7 d，其他操作同“1.3.4.1中a”。

c.初始pH值对发酵液抑菌活性的影响

将“1.3.1”种子液以10%(体积比)的接种量接入到装有200 mL初始pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的PDA培养基中，发酵培养7 d，其他操作同“1.3.4.1中a”。

d.培养时间对抑菌活性的影响

将“1.3.1”种子液以10%(体积比)的接种量接入到装有200 mL初始pH值为7.0的PDA培养基中，分别发酵培养3，5，7，9，11，13 d，其他操作同“1.3.4.1中a”。

e.摇床转速对发酵液抑菌活性的影响

将“1.3.1”种子液以10%(体积比)的接种量接入到装有200 mL初始pH值为7.0的PDA培养基中，分别发酵培养7 d，摇床转速分别为100，140，180，220 r/min，其他操作同“1.3.4.1中a”。

f.不同碳源及其质量浓度对抑菌活性的影响

分别选用不同的碳源(蔗糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖)制备PDA培养基，将“1.3.1”种子液以10%(体积比)的接种量分别接入到装有200 mL初始pH值为7.0的培养基中，发酵培养7 d，其他操作同“1.3.4.1中a”。

在筛选得到最佳碳源的基础上，优化不同质量浓度的碳源(即：分别将0%、0.5%、1%、1.5%、2%的碳源加入到培养基中)对抑菌活性的影响(n=3)。

g.不同氮源及其质量浓度对发酵液抑菌活性的影响

分别选用不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵)以1%的比例加入到PDA培养基中，其他条件及发酵培养同“1.3.4.1中f”。

在筛选得到最佳氮源的基础上，优化不同质量浓度的氮源(即：分别将0%、0.5%、1%、1.5%、2%的氮源加入到PDA培养基中)对抑菌活性的影响(n=3)。

1.3.4.2 正交实验

根据单因素实验筛选结果，选取碳源浓度、氮源浓度、培养时间和摇床转速4个因素作为实验因素，采用L9(34)正交实验设计优化发酵条件，因素水平见表1。

表1 正交实验因素和水平

1.3.5 内生真菌GP20的鉴定

内生真菌GP20形态学观察：参考文献[13]，观察 GP20于平板 PDA 培养基(28 ℃，7 d)上的菌落形状、颜色、浓密程度、基内菌丝形态及是否产色素等；同时，取 GP20 PDA平板(培养时间2 d)，将无菌盖玻片倾斜插入该平板中，继续培养 3 d后，取出，镊取盖玻片，置于显微镜下观察，初步确定菌株的分类地位[14]。

内生真菌GP20 ITS序列分析：参考文献[15]的方法提取菌株GP20进行DNA、PCR产物纯化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序工作。所测得序列提交GenBank 数据库，利用 MEGA 5.05构建系统发育树，确定GP20菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 内生真菌GP20发酵液活性成分分析结果

采用HPLC法对五味子内生真菌GP20发酵液活性成分进行分析，结果见图2。

图2 GP20发酵液活性成分分析结果

由图2可知，在五味子内生真菌GP20发酵液中含有香兰素，且空白对照无干扰。由此说明五味子内生真菌GP20为香兰素产生菌。

2.2 内生真菌GP20抑菌活性分析结果

对内生真菌GP20发酵液进行抑菌活性分析，结果见表2。

表2 GP20抑菌活性分析结果(n=3)

由表2可知，五味子内生真菌GP20对致病菌均有一定的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用最强，但对真菌(白色假丝酵母菌)则无任何影响。

2.3 内生真菌GP20发酵条件优化结果

2.3.1 单因素实验结果

2.3.1.1 接种量对抑菌活性的影响结果

在不同接种量条件下，GP20发酵液抑菌活性结果见图3。

图3 不同接种量对抑菌活性的影响

由图3可知，随着接种量的增加，GP20的抑菌活性逐渐增强，当接种量在15%时，GP20的抑菌活性最强，此后抑菌活性开始减弱。出现此现象的原因可能是接种量增加，抑菌活性物质含量增加，但接种量过多可能会导致菌体间产生相互竞争，使抑菌活性物质产量下降。

2.3.1.2 装液量对抑菌活性的影响结果

不同装液量对抑菌活性的影响结果见图4。

图4 不同装液量对抑菌活性的影响

由图4可知，装液量在20%～40%范围内变化时，GP20的抑菌活性较为稳定，当装液量持续增加时，抑菌活性逐渐减弱，这可能是由于装液量的增加稀释了抑菌活性物质浓度，从而使抑菌活性出现减弱的情况。

2.3.1.3 初始pH值对抑菌活性的影响结果

不同初始pH值对抑菌活性的影响结果见图5。

由图5可知，当发酵液初始pH值由4增至7时，GP20抑菌活性随着pH值的升高而增强，当pH值为7时，发酵液的抑菌活性最强，抑菌圈直径为(15.91±0.08) mm左右，此后，随着初始pH值的增加，GP20抑菌活性开始减弱。上述结果说明GP20最适初始pH值为7。

图5 不同初始pH值对抑菌活性的影响

2.3.1.4 摇床转速对抑菌活性的影响结果

不同摇床转速对抑菌活性的影响结果见图6。

图6 不同摇床转速对抑菌活性的影响

由图6可知，GP20的抑菌活性随着摇床转速的增长而表现出先增强后减弱的趋势，当摇床转速为180 r/min时，抑菌活性最强，但摇床转速过快也会影响GP20菌株的正常生长。

2.3.1.5 培养时间对抑菌活性的影响结果

GP20在不同培养时间下的抑菌活性测定结果见图7。

图7 不同培养时间对抑菌活性的影响

由图7可知，在不同的培养时间下，GP20的抑菌活性表现出先增强后减弱的趋势，这可能是由于GP20菌株培养时间不同，其生长期也不同，从而导致其次生代谢产物含量不同。当培养时间为9 d时，GP20的抑菌活性最强。

2.3.1.6 不同碳源对抑菌活性的影响结果

不同碳源的发酵液对抑菌活性的影响结果见图8。

图8 碳源对抑菌活性的影响

由图8可知，当葡萄糖、麦芽糖及蔗糖作为碳源时，GP20的抑菌活性无显著性差别。因此，分别选取0%、0.5%、1%、1.5%、2%蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为培养基的碳源，测定对GP20抑菌活性的影响，结果见图9。

图9 碳源质量浓度对抑菌活性的影响

由图9可知，当碳源浓度达到1%时，已基本满足GP20对碳源的需求，当碳源质量浓度继续增加时，GP20菌株的抑菌活性不再增强，并且随着碳源在培养基中剩余量的增加，GP20发酵液过于黏稠，从而增大后续次生代谢产物分离纯化时处理发酵液的难度。此外，用蔗糖作为碳源时，发酵后期会产生大量的多糖类物质，也会导致次生代谢产物分离的难度。因此，选用1%的葡萄糖作为培养基的碳源浓度。

2.3.1.7 不同氮源对抑菌活性的影响结果

不同氮源对抑菌活性的影响见图10，不同质量浓度的氮源对抑菌活性的影响见图11。

图10 氮源对抑菌活性的影响

图11 氮源质量浓度对抑菌活性的影响

由图10可知，蛋白胨和酵母膏作为氮源时，GP20的抑菌活性最强，且GP20菌株不能利用尿素、硫酸铵，GP20菌株在含有这两种成分的培养基中生长缓慢。

由图11可知，0.5%蛋白胨作为氮源时，GP20菌株发酵液的抑菌活性最强，因此选用0.5%的蛋白胨作为培养基的氮源。

2.3.2 正交实验结果

正交实验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 正交实验结果

表4 方差分析结果

由表3及表4可知，影响GP20抑菌活性的因素顺序为碳源质量浓度>氮源质量浓度>培养时间>摇床转速,碳源质量浓度对GP20抑菌活性的影响极显著，氮源质量浓度对抑菌活性的影响显著，培养时间和摇床转速对抑菌活性无显著影响，GP20的最优发酵条件为A2B3C1D2，即碳源(葡萄糖)质量浓度1%，氮源(蛋白胨)质量浓度1%，培养时间7 d，摇床转速180 r/min。结合单因素实验，GP20的最佳发酵条件为：1.0%葡萄糖，1.0%蛋白胨，装液量40%，接种量10%，初始pH值7.0，培养时间7 d，摇床转速180 r/min。

分别采用最佳发酵条件及“1.3.1”项发酵条件将内生真菌GP20发酵培养后进行抑菌实验，结果表明，采用最佳发酵工艺条件培养GP20后，其抑菌活性为(18.73±0.17) mm，比对照组的抑菌活性提高3.50 mm。

2.4 内生真菌GP20的鉴定结果

2.4.1 内生真菌GP20形态学观察结果

GP20菌落在培养初期呈白色，随着培养时间的延长，菌落颜色渐变为淡粉色，边缘整齐，紧贴培养基(见图12中a)，菌丝呈浅褐色，较致密，毡毛状(见图12中b)，产分生孢子，孢子呈球形或椭球形，不分泌可溶性色素(见图12中c)。

a.GP20菌落形态 b.GP20菌丝形态 c.GP20孢子显微结构

2.4.2 内生真菌GP20 ITS序列分析结果

五味子内生真菌 GP20 DNA PCR 扩增后获得1条600 bp的特异性条带，将测序结果在 GenBank 中进行 Blast 同源性比对，然后用 MEGA 5.05 软件构建系统发育树(见图13)，内生真菌 GP20 序列(登录号: KJ701756) 与PurpureocilliumlilacinumGU949611序列的同源性相似性为 99%。

图13 内生真菌GP20系统发育树

综合GP20形态学观察结果，将五味子内生真菌GP20鉴定为淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)。

3 结论

对五味子内生真菌GP20进行抑菌活性分析，结果表明，内生真菌GP20具有较好的抑菌活性；为了充分利用其抑菌次生代谢产物，对其发酵工艺进行了优化，GP20的最佳发酵工艺为：培养基中葡萄糖质量浓度1%，蛋白胨质量浓度1%，摇床培养时间7 d，摇床转速180 r/min。在此条件下，GP20香气更加浓郁，抑菌活性比未优化前提高了3.50 mm；采用HPLC法对GP20发酵液中次生代谢产物进行分析，结果显示，在GP20发酵液中含有香兰素，由此可知，GP20为香兰素产生菌。为了进一步开发利用GP20，对GP20进行了菌株鉴定，经鉴定，五味子内生真菌GP20为淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)。上述结果为采用微生物发酵法生产香兰素调味品奠定了基础。