晚期非小细胞肺癌中突变型p53和HIF-1α的表达及临床意义

金得芳，司马李杰，曾腾达，尹华婕，刘新福

(南华大学附属邵阳医院 血液肿瘤科，湖南 邵阳，422000)

据国际癌症研究机构统计[1]，2020年全球有220万的新增肺癌病例，其人数虽次于排在首位的女性乳腺癌，但肺癌的死亡人数却是最多的，每年估计有180万人死亡。非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占所有病例的85%，主要包括腺癌和鳞状细胞癌[2]。根治性手术是早期肺癌治疗的有效手段。但由于NSCLC发病比较隐蔽，仅约1/3的NSCLC患者能行手术切除治疗[3]，绝大多数患者在确诊时已处于局部晚期或远处转移晚期，失去了手术治疗的机会。近年来，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的出现[4]，已成为NSCLC治疗的重大突破。然而，随着临床的广泛应用，耐药性已成为一个新的问题。因此，寻找潜在的生物标志物来预测NSCLC的发生发展和预后显得格外重要。

p53是人类肿瘤中最重要的抑癌基因。在缺氧、DNA损伤、热休克等细胞应激条件下，转录形成的p53抑癌蛋白，能通过引发细胞凋亡、阻滞细胞周期和抑制血管生成等肿瘤抑制机制实现细胞基因组的完整性和动态平衡[5]。因此，p53也被称作“基因组守护者”[6]。但研究表明，50%的人类癌症中有p53突变，其中无义突变、移码缺失及错义突变是最常见的突变类型[7]。p53一旦发生突变，会丧失其维持基因组稳定性的功能，导致染色体或基因组不稳定，促进肿瘤的发生和发展。野生型p53蛋白半衰期短(5～30 min)、易分解、细胞内含量极低，难以检测到，但突变型p53蛋白的空间构象发生改变，稳定性高，可以通过免疫组织化学法能检测到[8]。因此，临床上用免疫组织化学法检测到的p53蛋白均为突变型。

缺氧是实体瘤中最常见和最明显的肿瘤微环境，而缺氧诱导因子1α[9](hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作为细胞缺氧反应的主要调节因子，能调节细胞凋亡、增殖、新陈代谢、免疫应答、侵袭和转移等过程[10]。研究表明，HIF-1α在多种实体瘤如宫颈癌、胃癌及大肠癌等中均是高表达的，与肿瘤的发生、发展密切相关[11]。

目前，国内外的很多研究发现,突变型p53和HIF-1α的表达水平与宫颈癌、乳腺癌及肝癌等多种癌症的发生发展及预后可能有关[5，11]。但较少有研究探讨突变型p53和HIF-1α的表达水平与NSCLC预后的关系。本研究通过免疫组织化学法检测突变型p53和HIF-1α在晚期NSCLC组织中的表达，探讨其表达与临床病理特征及预后的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

选取邵阳市中心医院2019年1月1日至2020年10月31日期间收治的200例晚期NSCLC患者。纳入标准:(1)有明确的病理诊断，按国际抗癌联盟(union for international cancer control,UICC)第8版肺癌TNM分期，均属于不可手术的IV期患者；(2)确诊后的预计生存期>3个月，有完整的随访资料；(3)确诊前未接受过放化疗、靶向治疗、免疫治疗等相关的抗肿瘤治疗。排除标准：(1)合并感染性、中毒性、血液性、创伤性及自身免疫性疾病者；(2)有严重的肝肾疾病或高度过敏体质者，不能耐受≥2个一线化疗周期；(3)确诊前合并≥2种原发肿瘤者；(4)行基因检测后，有驱动基因突变的NSCLC患者(如EGFR、ALK及ROS1等基因突变)。本研究经邵阳市中心医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集与随访

收集病人的临床资料(姓名、性别、年龄、吸烟史及饮酒史等)和病理资料(病理类型、肿瘤最大径及分化程度等)。从确诊日开始，通过查询门诊或住院复查资料、短信或电话随访等方式对患者进行随访。前3个月每月随访1次，3个月以后每3个月随访1次，共随访15个月，最后一次随访的截止日期为2022年1月31日。若期间死于其他疾病、失访及随访结束后仍然存活的患者视为删失数据。

1.2.2 免疫组织化学染色及苏木精-伊红染色

经病理确诊的200例晚期NSCLC患者癌组织的石蜡切片(厚4 μm)，依次在二甲苯I、二甲苯II溶液中进行脱蜡→梯度酒精(高浓度→低浓度)中脱掉二甲苯→蒸馏水充分冲洗。

1.2.2.1 免疫组化染色的具体步骤

(1)将切片放入CBS缓冲剂及蒸馏水配置的修复液中，采用高温高压法行抗原酸修复。

(2)PBS缓冲液冲洗修复后的切片，并放入3%的H2O2溶液中进行孵育。

(3)实验组滴加一抗(p53、HIF-1α鼠抗人单克隆抗体)，对照组用PBS缓冲液代替一抗，其应覆盖玻片上的全部组织，并在37 ℃的恒温孵育箱中孵育60 min。

(4)滴加生物素标记的二抗后，置于37 ℃的恒温孵育箱中孵育30 min。

(5)在切片上滴加DAB显色剂,显色5～8 min。

(6)滴加苏木素对切片上细胞核进行复染。

(7)常规脱水,透明,干燥,封片、观察。

1.2.2.2 苏木精-伊红(HE)染色的具体步骤

(1)将切片在苏木精染色液中染色5 min，用清水冲洗。

(2)用1%的盐酸酒精溶液分化3 s，用清水冲洗。

(3)0.5%的伊红水溶液染色2 min，用清水冲洗。

(4)常规脱水，透明，干燥，封片，观察。

1.2.3 免疫组化染色结果判读标准

由≥2位病理科医师采用半定量积分法[12-13]对结果进行判读，如遇到分歧，通过讨论得出一致结论。半定量积分=着色强度评分*阳性细胞所占比评分。着色强度评分：不着色 0分，淡黄色 1分，棕黄色 2分，黄褐色 3分；阳性细胞所占比评分：≤25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。定义评分<6为阴性表达，评分≥6为阳性表达。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 患者的一般资料特征

入组的200例患者，其中鳞癌108例，腺癌92例；年龄>60岁134例，<60岁66例；男136例，女64例；吸烟117例，不吸烟83例；饮酒109例，不饮酒91例；肿瘤最大径>3 cm 132例，<3 cm 68例；周围型98例，中央型102例；分化程度：高分化25例，中分化85例，低分化90例。

2.2 HE染色结果

200例晚期NSCLC组织中,苏木素-伊红(HE)染色结果为：(1)肺腺癌92例(46%)，其细胞异型性明显，结构不一，可见管状或腺样结构。(2)肺鳞状细胞癌108例(54%)，其组织中出现角化现象或细胞间桥(图1)。

图1 HE染色图片Fig.1 HE stained picture

2.3 晚期NSCLC组织中突变型p53和HIF-1α的表达

在200例晚期NSCLC患者中，突变型p53、HIF-1α阳性表达的分别为107例(53.5%)和147例(73.5%)；突变型p53主要在细胞核内表达，呈棕黄色颗粒状着色，HIF-1α主要在细胞核内表达，但在细胞质中也有表达，呈黄褐色颗粒状着色(图2)。

图2 部分免疫组化染色图片Fig.2 Part of the immunohistochemical staining pictures

2.4 晚期NSCLC中突变型p53和HIF-1α的表达与临床病理特征的关系

突变型p53的表达与吸烟史、肿瘤分化程度相关(P<0.05)，突变型p53在有吸烟史的患者中阳性表达率高于无吸烟史者，在低分化组织中的阳性表达率高于中、高分化组织(P<0.05)；HIF-1α的表达与肿瘤分化程度有关(低分化、中分化和高分化组织中HIF-1α阳性表达率分别为60.0%、68.2%和82.2%，χ2=7.064，P=0.029)。见表1。

表1 晚期NSCLC组织中突变型p53、HIF-1α蛋白表达与临床病理特征的关系

2.5 晚期NSCLC中突变型p53和HIF-1α表达水平的相关性

应用Spearman秩相关分析研究突变型p53和HIF-1α在晚期NSCLC中表达的相关性，发现突变型p53和HIF-1α的表达呈正相关(rs=0.167，P=0.018)。见表2。

表2 晚期NSCLC中突变型p53和HIF-1α表达的关系

2.6 晚期NSCLC组织中突变型p53、HIF-1α的表达与患者预后的关系

突变型p53阳性表达组的中位总生存期要低于阴性表达组，中位总生存期分别为10.6个月、7.6个月，χ2=21.573，P=0.001；HIF-1α阳性表达组的中位总生存期为8.3个月，阴性表达组的中位总生存期为10.9个月，两组间的差异有统计学意义(χ2=9.353，P=0.002，图3和图4)。

图3 晚期NSCLC中突变型p53蛋白表达与患者预后的关系Fig.3 Relationship between expression of mutant p53 protein and prognosis of patients with advanced NSCLC

图4 晚期NSCLC中突变型p53蛋白表达与患者预后的关系Fig.4 Relationship between the expression of mutant p53 protein in advanced NSCLC and prognosis of patients

2.7 影响晚期NSCLC预后的因素分析

2.7.1 单因素COX回归分析

在单因素COX回归分析中，以生存结局为因变量(删失=0，死亡=1)，突变型p53、HIF-1α等分类变量作为协变量，见表3。结果显示，病理类型、突变型p53表达及HIF-1α表达与患者的总生存期相关(P<0.05)。而年龄、性别、病理类型、吸烟史、肿瘤最大径、分化程度、肿瘤部位及饮酒史与患者的预后无关(P>0.05)，见表4。

表3 晚期NSCLC预后的影响因素与赋值

表4 影响NSCLC患者预后的Cox单因素分析

2.7.2 多因素COX回归分析

将单因素COX回归分析中有意义的自变量纳入多因素COX回归分析中。结果显示，突变型p53、HIF-1α表达与患者的总生存期相关(P<0.05)，而病理类型与总生存期无关(P<0.05)。见表5。

3 讨论

p53是LANE等[14]于1979年在SV40转化的小鼠细胞中发现的一种转录因子，在癌症生物学中起重要的调控作用。p53分为野生型p53和突变型p53两种亚型。当细胞受到压力或损伤时，野生型p53基因编码的p53蛋白能阻止受损的细胞增殖，降低细胞所出现的癌变风险。在许多情况下，可通过触发各种下游通路来激活细胞的程序性死亡(凋亡)，进而保护机体[15]。而突变型p53可以通过阻碍正常p53蛋白的合成或通过改变正常p53蛋白中的DNA结合结构域，进而损害正常p53蛋白抑制肿瘤发生和发展的能力，促进细胞增殖与癌变[16]。DING等[17]对188例肺癌患者的DNA进行测序后发现，吸烟者中p53的突变概率显著高于从不吸烟的个体，表明p53突变与吸烟密切有关。而最近，ZHOU等[12]通过免疫组织化学的方法也观察到p53蛋白的表达水平与吸烟状况有很强的相关性(P=0.007)。韩丽丽等[18]发现突变型p53表达与分化程度、TNM分期相关。本研究应用免疫组织化学法检测200例晚期NSCLC组织中p53的表达，结果与文献[12，17-18]研究结果一致，即p53在晚期NSCLC中的表达与吸烟、肿瘤的分化程度密切相关。另外，研究发现，与野生型p53患者相比，突变型p53患者的OS及PFS较差[19]。而最近，TOMASINI等[20]对218例NSCLC患者进行研究后得出，与p53突变组相比，不伴有p53突变的患者的OS更长。本研究利用Kaplan-Meier生存曲线分析突变型p53的表达水平与生存时间的关系，发现p53阳性表达组的生存时间要低于p53阴性表达组，差异有统计学意义。经进一步的多因素COX回归分析后，发现突变型p53是晚期NSCLC患者预后的一个独立危险因素。

肿瘤的分化程度是指肿瘤组织在形态和功能上与某种正常组织的相似程度[21]，肿瘤组织分化程度越低，提示恶性程度越高，转移复发的可能性越大。本研究发现HIF-1α的表达与组织的分化程度存在相关性，且与文献[22-23]的研究结果相一致，即低分化的肺癌组织中HIF-1α的表达水平要高于中、高分化组织，这提示HIF-1α的表达可能与肺癌的恶性程度有关，在肿瘤的侵袭转移中发挥一定的作用。然而，ZHENG等[13]发现HIF-1α的表达与NSCLC的分化程度无相关性(P>0.05)。邓万生等[24]也发现HIF-1α的表达与分化程度无关。因此，对于HIF-1α是否与分化程度存在相关性，尚不是很清楚，这可能与研究中纳入的人群、HIF-1α的检测试剂和方法、免疫组织化学判读标准等的不同相关，未来还需要更大规模的、多中心的研究来进一步明确。目前，关于HIF-1α的表达与预后的关系，大多数研究都集中在可手术的NSCLC患者，如李黎等[25]通过评估77例手术治疗的NSCLC患者，发现HIF-1α阳性表达的患者会出现更低的生存率。ZHENG等[13]研究结果也表明，HIF-1α可能是预测256例早期NSCLC患者预后的一个潜在标志物。本研究利用Kaplan-Meier生存曲线分析突变型p53的表达水平与总生存期的相关性，发现HIF-1α阴性表达组的中位总生存期要高于HIF-1α阳性表达组。用多因素COX回归分析发现，HIF-1α阳性表达是影响晚期NSCLC患者预后的一个独立危险因素。通过Spearman秩相关分析发现晚期NSCLC中突变型p53与HIF-1α的表达呈正相关，这可能为以p53和HIF-1α为靶点的联合治疗NSCLC提供了依据。

综上所述，晚期NSCLC患者癌组织中，突变型p53的表达与吸烟史及分化程度相关，HIF-1α的表达与分化程度相关，两者的表达呈正相关。突变型p53、HIF-1α的表达水平可作为晚期NSCLC预后的预测指标。