LncRNA TSPOAP1-AS1对缺糖缺氧处理的脑微血管内皮细胞存活的影响

李辉，肖嫦娥，游涛

(邵阳学院附属第一医院 神经内科，湖南 邵阳，422000)

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是全世界成年人死亡和永久残疾的主要原因，具有较高患病率、致残率、病死率，严重影响着患者的身心健康与生活质量[1]。脑缺血或缺氧会破坏作为血脑屏障重要结构的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial,BMECs)间的连接、细胞结构和功能等，从而损伤脑细胞和脑组织，造成脑功能紊乱[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，可以在转录水平和转录后水平上调基因的表达。近年来有报道称，lncRNAs可调节脑卒中后BMEC的存活、炎症反应和血管生成[3-4]。LncRNA TSPOAP1-AS1(ENSG00000265148.5)，又名BZRAP1-AS1，参与肝癌、前列腺癌等的发生发展[5-6]。然而，关于其在脑卒中的作用鲜有报道。本研究首先分析IS患者血清样本中TSPOAP1-AS1的表达水平，然后拟体外培养小鼠BMECs，通过氧糖剥夺实验建立细胞缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)损伤模型，研究lncRNA TSPOAP1-AS1在OGD条件下对人BMECs存活的影响，为IS防治寻找新的潜在靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2021年5月至10月期间邵阳学院附属第一医院就诊后确诊的10例IS患者作为试验组，另外收集10例同期来本医院进行健康体检的健康者作为对照组。两组性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。入选标准：(1)病症符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[7]中IS诊断的准则；(2)首次经头颅CT或MRI确诊；(3)发病时间在72 h以内，且在住院24 h内完成其静脉血液样本收集；(4)无精神系统方面的疾病。剔除标准：(1)伴有重要脏器器质性损伤;(2)伴有脑出血、恶性肿瘤、严重感染等;(3)在确诊前3个月内有服用叶酸、维生素B12、B6等药剂；(4)有心理精神疾病并服用精神类药剂的。所有参与者均了解研究内容，并签署知情同意书。空腹状态采集所有受试者的肘静脉血5 mL，离心分离血清，-80 ℃冰箱保存，实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)检测样本中TSPOAP1-AS1的相对表达水平。本研究经邵阳学院附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 主要实验材料

小鼠BMECs购买于中国科学院上海生科院细胞资源中心；无糖和正常糖的DMEM培养液和胎牛血清均购自美国GIBCO公司；TRIzol和Lipofectamine 2000试剂盒均购于美国Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit和qPCR试剂购于日本Taraka公司；MTS细胞增殖检测试剂盒购于美国Promega公司；lncRNA TSPOAP1-AS1干扰序列(si-TSPOAP1-AS1)和对照(negative Control)序列(si-NC)购于苏州吉玛基因股份有限公司。

1.3 细胞培养和OGD损伤模型的构建

小鼠BMECs在使用前细胞已经生长到大约90%的融合度，为模拟OGD缺血样条件，BMECs接种在无糖的DMEM细胞培养液中，然后置于37 ℃、95% N2、5% CO2气体培养箱中培养6 h。对照组BMECs在正常条件下培养6 h。RT-qPCR检测细胞中TSPOAP1-AS1的相对表达水平。

1.4 细胞转染和实验分组

在正常条件下培养细胞，当细胞进入指数增长时收集细胞，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行si-TSPOAP1-AS1和si-NC转染。将细胞分为si-NC+OGD组(细胞转染si-NC后OGD处理6 h)；si-TSPOAP1-AS1+OGD组(细胞转染si-TSPOAP1-AS1后OGD处理6 h)。RT-qPCR检测细胞中TSPOAP1-AS1的相对表达水平。

1.5 RT-qPCR

TRIzol试剂提取血清样本、经培养或转染后的细胞中的总RNA，检测浓度和质量后将总RNA反转录成cDNA，根据试剂说明书配置qPCR体系，检测样本中TSPOAP1-AS1表达水平。以β-actin作为内参，根据2-ΔΔCt法计算TSPOAP1-AS1相对表达。

1.6 MTS实验

MTS实验检测上述两组转染后细胞增殖。将接种转染后的细胞至96孔板中，各组设置3个复孔，随后将细胞经OGD处理6 h，正常条件下培养24、48、72 h后，按照MTS检测试剂盒方法用酶标仪测定细胞在490 nm波长下的吸光度，计算细胞的存活率。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 IS患者血清中TSPOAP1-AS1表达水平

RT-qPCR结果表明，IS患者和健康体检者血清中TSPOAP1-AS1相对表达水平分别为5.28±1.45和0.99±0.358。与健康体检者相比，IS患者血清中TSPOAP1-AS1水平显著升高，差异有统计学意义(t=15.12，P<0.001)。

2.2 OGD损伤模型细胞中TSPOAP1-AS1的表达水平

RT-qPCR结果显示，正常条件下培养的BMECs和OGD损伤模型BMECs中TSPOAP1-AS1的相对表达水平分别为0.98±0.66和6.73±4.80。与正常条件培养相比，OGD损伤模型BMECs中TSPOAP1-AS1相对表达水平显著升高，差异有统计学意义(t=3.75，P=0.002)。

2.3 干扰OGD损伤模型细胞中TSPOAP1-AS1的表达

RT-qPCR结果显示，经转染后的OGD损伤模型细胞，si-NC+OGD组和si-TSPOAP1-AS1+OGD组中TSPOAP1-AS1的相对表达水平分别为1.00±0.15和0.03±0.01。与si-NC+OGD组相比，si-TSPOAP1-AS1+OGD组中TSPOAP1-AS1的相对表达水平显著降低，差异有统计学意义(t=9.40，P=0.001)。

2.4 干扰TSPOAP1-AS1表达对OGD损伤模型细胞存活率的影响

MTS实验结果显示，与si-NC+OGD组相比，si-TSPOAP1-AS1+OGD组细胞在培养24、48、72 h这3个时间点的存活率均显著增大，且培养时间越长存活率差异相对越大，见表1。

表1 MTS实验检测干扰TSPOAP1-AS1表达对OGD损伤模型细胞的存活率的影响

3 讨论

IS给患者和社会带来沉重的经济负担，尽管在临床上血管再通治疗取得了一定的进展，但IS的治疗选择仍然非常有限[8]。因此，迫切需要寻找新的有效治疗IS的方式和靶点。

lncRNA作为一类发挥调控作用的非编码RNA，被当作一种新的生物标志物引起广泛关注。在IS患者和动物模型中发现了数百种异常表达的lncRNA，与IS密切相关[9]。最新研究发现，lncRNA TSPOAP1-AS1与阿尔茨海默病的危险因子基因滋养层糖蛋白相互作用，与阿尔茨海默病的进展密切相关[10]。本研究发现在IS患者血清中TSPOAP1-AS1表达异常升高，表明TSPOAP1-AS1可能参与IS病理过程。BMECs在IS过程中起重要作用。研究发现，MMP通过促进BMECs中的炎症反应增强MMP-2表达和金属蛋白酶抑制剂1的释放，介导血脑屏障分解[11]。越来越多的研究证实，保持BMECs的存活、再生以及抑制凋亡可以减轻缺血或缺氧引起的血脑屏障损伤[12]。因此，靶向BMEC是一种很有前途的针对IS的治疗方法，通常在体外使用OGD模型诱导细胞。而lncRNA作为一种与细胞分化、增殖等生理和病理相关的调控分子，与BMECs的存活、再生、凋亡等密切相关[13]，如lncRNA NEAT 1通过靶向miR-377和促进VEGFA、SIRT 1和BCL-XL的表达，改善OGD诱导的BMECs存活和血管生成[14]。因此，本研究随后利用OGD模型诱导BMECs，研究TSPOAP1-AS1对OGD诱导的BMECs存活的影响，发现BMECs经OGD诱导后细胞中TSPOAP1-AS1表达异常升高，与其在IS患者血清中表达相似。干扰BMECs中TSPOAP1-AS1表达能够提高OGD处理BMECs的存活率，表明干扰BMECs中TSPOAP1-AS1表达能够促进OGD处理的BMECs存活。虽然证实了TSPOAP1-AS1对OGD处理的BMECs存活发挥重要的调控作用，但是关于TSPOAP1-AS1对OGD处理BMECs存活的调控机制、其在IS中的具体作用等还需要在后续的研究中进行证实。

证实了TSPOAP1-AS1在IS患者血清和OGD处理的BMECs中高表达，干扰TSPOAP1-AS1表达能够促进OGD处理的BMECs存活。TSPOAP1-AS1可以作为IS治疗潜在的新靶点，具有临床应用前景，但是其具体机制和效应仍需深入研究和验证。