LncRNA MEG3与miR-31在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用及意义

张 刚，李哲丽，刘玉凤，郑少华，赵 芝，牛国超

据统计，结肠癌发病率居胃肠道恶性肿瘤的第3位，发病机制与遗传、环境等多种因素导致结肠黏膜上皮基因改变密切相关[1]。明确相关基因作用机制对早期防治结肠癌具有重要意义[2-3]。长链非编码RNA(LncRNA)与肿瘤侵袭、转移及预后情况联系紧密。有研究表明，LncRNA母系印记基因3(LncRNA MEG3)在正常组织中表达，但在多种肿瘤细胞中呈现表达缺失现象，具有抑癌作用[4]。微小RNA(miRNA)属于内源性单链小分子非编码RNA，其中miR-31异常表达会影响肿瘤相关基因活性，参与肿瘤细胞增殖、侵袭过程[5]。但关于二者在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用仍不明确。故本研究尝试探讨LncRNA MEG3与miR-31在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用及意义，旨在为防治结肠癌及癌前病变提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2016年6月—2018年8月手术切除的62例结肠腺瘤组织、62例结肠腺瘤癌前病变组织、62例结肠癌组织。纳入标准：经内镜形态学及病理检查证实肿瘤性质；未合并其他部位恶性肿瘤；所有组织标本经手术切除后冷冻保存；临床资料完整。排除标准：肿瘤性质难以明确者；合并其他恶性肿瘤者；存在其他结直肠疾病者。62例结肠腺瘤患者中男35例，女27例；年龄34～68(48.67±4.06)岁；体质量指数(BMI)为17～30(21.95±1.46)kg/m2。62例结肠腺瘤癌前病变患者中男33例，女29例；年龄32～69(48.13±5.05)岁；BMI为18～30(22.18±1.22)kg/m2。62例结肠癌患者中男36例，女26例；年龄33～70(49.03±5.34)岁；BMI为18～31(22.30±1.43)kg/m2。3组性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 取100 mg冻存的结肠腺瘤、结肠腺瘤癌前病变、结肠癌组织放置于研磨器中，加入Trizol 1 ml后置于液氮中将组织标本磨成粉末状，提取RNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，在-80 ℃恒温冰箱内保存备用。LncRNA MEG3、miR-31、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。遵循美国BIOMIGA公司SYBR Green Ⅰ说明书配置反应体系，取cDNA采用LightCycler96荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行40个循环，每个样品设置3个复孔，反应结束后得到各反应管循环阈值，以GAPDH作为LncRNA MEG3内参，U6作为miR-31内参，以2-ΔΔCq法计算LncRNA MEG3、miR-31相对表达量。

1.3观察指标 ①不同序列转化阶段LncRNA MEG3、miR-31相对表达量；②LncRNA MEG3与miR-31表达在不同序列转化阶段的相关性；③LncRNA MEG3与miR-31表达在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用；④LncRNA MEG3、miR-31表达与结肠癌患者病理特征的相关性；⑤LncRNA MEG3、miR-31表达对结肠癌患者生存率与死亡危险度的影响。

2 结果

2.1不同序列转化阶段LncRNA MEG3、miR-31相对表达量 LncRNA MEG3相对表达量在结肠腺瘤-癌序列转化中呈逐渐下降趋势，miR-31相对表达量在结肠腺瘤-癌序列转化中呈逐渐升高趋势(P<0.01)，见表1。

表1 不同结肠腺瘤-癌序列转化阶段LncRNA MEG3、miR-31相对表达量

2.2LncRNA MEG3与miR-31表达在不同序列转化阶段的相关性 Pearson相关性分析显示，LncRNA MEG3与miR-31在结肠腺瘤、结肠腺瘤癌前病变、结肠癌组织中均呈负相关(r=-0.741、-0.753、-0.774，P<0.05)，见图1。

2.3LncRNA MEG3与miR-31表达在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用 LncRNA MEG3与miR-31表达在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用分析显示,LncRNA MEG3单独低表达所致结肠腺瘤-癌序列转化的OR值为13.050，miR-31单独高表达所致的结肠腺瘤-癌序列转化的OR值为4.641，二者同时存在时，交互作用OR值为30.375，γ为2.244，提示LncRNA MEG3低表达与miR-31高表达在结肠腺瘤-癌序列转化中呈正向交互作用(为次相乘模型)。见表2。

表2 LncRNA MEG3与miR-31表达在结肠腺瘤-癌序列转化中的交互作用

2.4LncRNA MEG3、miR-31表达与结肠癌患者病理特征的相关性 LncRNA MEG3、miR-31相对表达量与结肠癌患者年龄、性别、肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)；LncRNA MEG3相对表达量与结肠癌患者临床分期、淋巴结转移呈负相关，与结肠癌组织分化程度呈正相关，miR-31相对表达量与结肠癌组织临床分期、淋巴结转移呈正相关，与结肠癌组织分化程度呈负相关(P<0.01)。见表3。

表3 LncRNA MEG3、miR-31表达与结肠癌患者病理特征的相关性

2.5LncRNA MEG3、miR-31表达对结肠癌患者生存率与死亡危险度的影响 KM生存曲线分析，LncRNA MEG3低表达结肠癌患者3年生存率低于高表达患者，miR-31高表达的结肠癌患者3年生存率低于低表达患者(P<0.05)，见图2。经RR检验，LncRNA MEG3低表达结肠癌患者3年内死亡危险度是高表达患者的7.000倍(95%CI：1.027，47.704)；miR-31高表达结肠癌患者3年内死亡危险度是低表达患者的4.810倍(95%CI：1.846，12.536)。见表4。

表4 LncRNA MEG3、miR-31表达对结肠癌死亡危险度的影响

3 讨论

结肠腺瘤是临床常见胃肠道良性肿瘤，发病与居民饮食习惯、生活方式等因素密切相关，若未得到及时有效干预，随着病情进展可引发癌前病变，最终发展为结肠癌[6-8]。因此，积极探索结肠腺瘤-癌序列转化中基因改变的作用机制对降低癌前病变、结肠癌发生风险，延长结肠癌患者生存期具有重要意义。LncRNA是一类长度>200 nt的非编码RNA，具有广泛的生物学功能，可通过调控DNA转录在多种疾病中发挥作用。LncRNA MEG3属于小鼠母体印记基因Glt2的人类同系物，定位于染色体14q32，是第一个有肿瘤抑制功能的LncRNA[9-10]。既往多项研究表明，LncRNA MEG3在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中发挥调控肿瘤细胞作用，且在上述恶性肿瘤细胞中表达缺失[11-12]。本研究发现，LncRNA MEG3相对表达量在结肠腺瘤-癌序列转化中呈逐渐下降趋势，可见LncRNA MEG3低表达能促进结肠腺瘤-癌序列转化过程。分析原因，主要是由于LncRNA MEG3可作为抑癌因子发挥作用，能够启动肿瘤细胞凋亡机制，激活内源性凋亡途径，抑制内质网应激因子、Bcl-2活性，上调Bax表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，因此在结肠腺瘤-癌序列转化过程中LncRNA MEG3为满足抑制肿瘤细胞、增殖需求而被过度损耗，呈现低表达甚至表达缺失现象[13]。胥光热等[14]报道证实，在结肠癌细胞中敲减LncRNA MEG3后肿瘤细胞增殖显著加快。本研究数据表明，LncRNA MEG3相对表达量与临床分期、淋巴结转移呈负相关，与肿瘤分化程度呈正相关，与上述研究结论相符，说明LncRNA MEG3低表达会加快结肠癌进展，可作为临床预测结肠腺瘤向结肠癌转化的重要指标。

miRNA属小分子单链非编码RNA，广泛表达于真核生物内，成熟的miRNA具有调控基因表达作用。miR-31是与肿瘤相关的热点基因，定位于9p21.3，具有调节胚胎着床、发育功能，在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用[15-17]。张翌等[18]研究显示，miR-31过表达能促进结肠腺瘤恶性转化，加快结肠癌发生。本研究结果显示，miR-31相对表达量在序列转化中呈逐渐升高趋势，且与结肠癌患者临床分期、淋巴结转移呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关，提示miR-31过表达不仅会促进结肠腺瘤-癌序列转化，还与结肠癌患者病理进展显著相关。推测主要原因：①miR-31过表达能下调上皮标志物表达，上调间质标志物表达，从而增强肿瘤增殖能力，促进结肠癌发生发展[19]；②miR-31能异常激活Wnt/β-catenin信号通路，导致该信号通路靶基因异常表达，提高肿瘤细胞侵袭、迁移能力，进而促进结肠癌的发生及进展[20]；③miR-31基因启动子区的甲基化会导致miR-31异常表达，影响下游转录因子活性，加快肿瘤细胞分化、浸润[21]。故miR-31有望成为结肠腺瘤向结肠癌转化的标志物，能为临床制定科学防治措施提供有效信息。

本研究尝试探讨LncRNA MEG3与miR-31在结肠腺瘤-癌序列转化过程中的关系及交互作用，结果显示二者在结肠腺瘤-癌序列转化过程中呈负相关，且LncRNA MEG3低表达与miR-31高表达在结肠腺瘤-癌序列转化中呈正向交互作用(为次相乘模型)，提示LncRNA MEG3低表达与miR-31高表达对结肠腺瘤-癌序列转化具有促进作用。此外本研究还发现，LncRNA MEG3低表达结肠癌患者3年生存率低于高表达患者，死亡危险度是高表达患者的7.000倍，miR-31高表达结肠癌患者3年生存率低于低表达患者，死亡危险度是低表达患者的4.810倍，佐证了LncRNA MEG3低表达与miR-31高表达会对结肠癌患者生存状况产生明显影响。但本研究属于单中心、小样本分析，可能造成数据偏倚，需收集更多病例做进一步分析，以获取更为可靠的数据支持。

综上，LncRNA MEG3低表达与miR-31高表达在结肠腺瘤-癌序列转化中具有正向交互作用，且二者均与结肠癌患者病理特征、生存状况密切相关，能为临床制定治疗方案、预测预后提供有效信息。