知母皂苷AⅢ通过OXCT1-AS1/miR-874-3p抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的机制研究

庄俊嵘 刘瑾 秦怡琼

肝癌是我国病死率较高的恶性肿瘤之一，近年来中药提取物具有抗肝癌的作用，可有效患者术后不良反应，提高患者免疫力，改善患者生活质量等[1,2]。因此，开发有效抗肝癌的中药对其治疗具有重要意义。中药知母是目前常用的中药材，知母皂苷AⅢ是知母中的主要甾体皂苷，具有抗炎，降糖，抗肿瘤等作用[3]。研究报道知母皂苷AⅢ能抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞的增殖生长[4]。知母皂苷AⅢ可通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡，进而抑制细胞活力[5]。知母皂苷AⅢ通过干预MAPK及Wnt/β-catenin信号通路而抑制脑胶质瘤U87MG的增殖[6]。知母皂苷AⅢ通过AKT/miR-129-5p轴抑制CTSC的表达来抑制肾癌细胞的转移[7]。然而知母皂苷AⅢ对肝癌细胞增殖、迁移侵袭的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-874-3p通过下调PIN1抑制体外肝癌细胞生长和集落形成，并促进细胞凋亡[8]。生物学软件预测发现miR-874-3p与lncRNA OXCT1-AS1有结合位点。研究发现OXCT1-AS1在膀胱癌细胞中上调表达，通过miR-455-5p/JAK1信号传导促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭[9]。本实验旨在研究知母皂苷AⅢ对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其是否与OXCT1-AS1、miR-874-3p有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HCC9204细胞购自美国ATCC；RPMI-1640培养基、MTT试剂盒、结晶紫染色液购自美国Sigma公司；知母皂苷AⅢ购自上海赛可锐生物科技有限公司；Transwell小室、基质胶购自美国康宁公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海群己生物科技有限公司。

1.2 细胞处理与分组 HCC9204细胞用RPMI-1640培养基常规培养，分别用0、4、8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理，作为不同浓度知母皂苷AⅢ组，其中16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理的细胞又记为知母皂苷AⅢ组。将si-NC、si-OXCT1-AS1、pcDNA、pcDNA-OXCT1-AS1转染至HCC9204细胞，用RT-qPCR检测OXCT1-AS1表达水平，以确认转染效率。将si-NC、si-OXCT1-AS1转染至HCC9204细胞，记为si-NC组、si-OXCT1-AS1组；将pcDNA-OXCT1-AS1、miR-874-3p inhibor转染至HCC9204细胞后用16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理，记为知母皂苷AⅢ+pcDNA-OXCT1-AS1组、知母皂苷AⅢ+miR-874-3p inhibor组。

1.3 MTT检测细胞增殖抑制率 各组细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。计算细胞增殖抑制率(%)。

1.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成数 各组细胞接种于6孔板，培养2周，甲醇固定后用结晶紫染色，光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.5 Transwell检测迁移与侵袭细胞数 迁移：取100 μl 无血清培养液悬浮的细胞至Transwell上室，下室加含血清培养液，培养24 h，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机选取五个视野记数迁移细胞。侵袭：用基质胶包被Transwell上室，其余同迁移操作。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测OXCT1-AS1和miR-874-3p的表达水平 提取各组总RNA，合成cDNA后以GAPDH和U6为内参进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.7 双荧光素酶报告实验 将OXCT1-AS1野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-874-3p共转染至HCC9204细胞，按照说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 知母皂苷AⅢ对HCC9204增殖迁移侵袭的影响 不同浓度知母皂苷AⅢ处理后，随着药物浓度增加，HCC9204细胞增殖抑制率逐渐升高，克隆形成数、迁移和侵袭细胞数逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

表1 知母皂苷AⅢ抑制HCC9204增殖迁移侵袭

图1 知母皂苷AⅢ抑制HCC9204迁移侵袭(结晶紫染色×200)

2.2 知母皂苷AⅢ对HCC920中OXCT1-AS1、miR-874-3p表达的影响 不同浓度知母皂苷AⅢ处理后，随着药物浓度增加，OXCT1-AS1表达水平逐渐降低，miR-874-3p表达水平逐渐升高(P<0.05)。见表2。

表2 知母皂苷AⅢ抑制OXCT1-AS1促进miR-874-3p的表达

2.3 OXCT1-AS1、miR-874-3p靶向关系验证 Starbase预测显示OXCT1-AS1和miR-874-3p有互补序列；miR-874-3p与WT-OXCT1-AS1共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)。见图2，表3。

图2 OXCT1-AS1和miR-874-3p的互补序列

表3 荧光素酶活性

2.4 OXCT1-AS1处理后转染效率的检测 si-OXCT1-AS1组OXCT1-AS1表达水平低于si-NC组(P<0.05)；pcDNA-OXCT1-AS1组OXCT1-AS1表达水平高于pcDNA组。见表4。

表4 OXCT1-AS1表达的检测

2.5 下调OXCT1-AS1对HCC9204增殖迁移侵袭的影响 与si-NC组比较，si-OXCT1-AS1组miR-874-3p表达水平升高，HCC9204增殖抑制率升高，克隆形成细胞数、迁移和侵袭细胞数减少(P<0.05)。见图3，表5。

图3 下调OXCT1-AS1抑制HCC9204迁移侵袭(结晶紫染色×200)

表5 下调OXCT1-AS1抑制HCC9204增殖迁移侵袭

2.5 OXCT1-AS1过表达或miR-874-3p抑制对知母皂苷AⅢ处理的HCC920增殖迁移侵袭的作用 与知母皂苷AⅢ组比较，知母皂苷AⅢ+pcDNA-OXCT1-AS1组和知母皂苷AⅢ+miR-874-3p inhibor组miR-874-3p表达水平降低，HCC9204增殖抑制率降低，克隆形成细胞数、迁移和侵袭细胞数增多，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，表6。

表6 OXCT1-AS1过表达或miR-874-3p抑制可逆转知母皂苷AⅢ对HCC920增殖迁移侵袭的抑制作用

图4 OXCT1-AS1过表达或miR-874-3p抑制可逆转知母皂苷AⅢ对HCC920迁移侵袭的抑制作用(结晶紫染色×200)

3 讨论

中医药联合分子靶向药物是当前治疗肝癌的一个重要治疗手段，值得临床推广运用[10,11]。研究报道知母皂苷AⅢ通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导T细胞急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的凋亡和自噬[12]。高浓度的知母皂苷AⅢ可诱导肺癌细胞凋亡[13]。知母皂苷AⅢ可通过抑制STAT3和ERK1/2通路诱导胰腺癌细胞凋亡并抑制细胞增殖[14]。知母皂苷AⅢ通过激活ATM/Chk2和p38 MAPK信号通路诱导乳腺癌G2/M期阻滞和细胞凋亡[15]。以上研究表明知母皂苷AⅢ具有抗多种肿瘤的作用。本实验表明知母皂苷AⅢ可浓度依赖性抑制HCC920细胞增殖、迁移和侵袭。

研究报道OXCT1-AS1在胶质母细胞瘤组织中上调表达，且预示着预后不良；抑制 OXCT1-AS1表达通过调节miR-195-5p/CDC25A轴抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭；是一种特异性肿瘤标志物，肿瘤治疗的潜在靶点[16]。本实验结果：表明下调OXCT1-AS1可抑制HCC920细胞增殖、迁移和侵袭。生物学软件预测发现OXCT1-AS1与miR-874-3p有结合位点。且本实验证实OXCT1-AS1可靶向调控miR-874-3p。已有研究报道miR-874-3p可抑制肝癌细胞生长[8]。提示，OXCT1-AS1可通过调控miR-874-3p影响肝癌进展。

此外，本实验结果还提示，知母皂苷AⅢ可通过调控OXCT1-AS1/miR-874-3p抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。