circ_0000069通过靶向miR-1182调控骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

王玉萍 王振 张爱忠

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，扩散迅速，最常见于儿童和青少年[1,2]。在发病位置方面，骨肉瘤常见于长骨干骺端，如股骨远端、胫骨近端和肱骨近端[3]。尽管骨肉瘤的早期诊断和联合治疗已有所发展，并且数据显示患者5年生存率显著提高，但复发性和转移性骨肉瘤患者的预后仍较差[4]。截肢虽可挽救患者生命，但也严重影响了患者身心健康[5]。因此，研究骨肉瘤病理机制，寻找新的分子标志物，对骨肉瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。环状RNA(circRNAs)是一种新型单链非编码RNA转录本，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。研究发现，敲除circ_0000069可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。circ_0000069在宫颈癌中表达上调，与患者淋巴结转移及预后不良密切相关，可促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[7]。在胰腺癌组织和细胞系中，circ_0000069表达明显上调，下调其可诱导胰腺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，抑制细胞增殖、迁移、侵袭和异种移植瘤生长[8]。Circinteractome预测显示，circ_0000069与miR-1182 之间存在核苷酸结合位点。研究报道，miR-1182在骨肉瘤组织和细胞中低表达[9]。因此，本实验旨在研究circ_0000212在骨肉瘤中的作用及其是否可通过调控miR-1182表达影响骨肉瘤细胞MG-63的增殖、迁移和侵袭。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2017年1月至2019年1月经病理检测为骨肉瘤的患者30例，获得原发性骨肉瘤组织及相应癌旁组织，每位患者均知情且同意，手术切除后立即将样本保存在-80℃。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 材料 骨肉瘤细胞株MG-63购自中科院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；Trziol试剂、反转录、qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；MTT试剂盒购自美国Sciencell公司；Transwell小室购于美国密理博公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；

1.3 细胞转染与分组 取对数生长期MG-63细胞，将si-NC、si-circ_0000069、miR-NC、miR-1182分别转染至MG-63细胞，记为si-NC组、si-circ_0000069组、miR-NC组、miR-1182组；将si-circ_0000069分别与anti-miR-NC、anti-miR-1182共转染至MG-63细胞，记为si-circ_0000069+anti-miR-NC组、si-circ_0000069+anti-miR-1182组。

1.4 RT-qPCR 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，circ_0000069、miR-1182分别以GAPDH、U6为内参，相对表达量采用2-△△Ct法计算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 MTT 取各组MG-63细胞(2.5×104个/ml)，接种于96孔板(100 μl/L)，培养48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔，培养4 h，弃上清，加入DMSO 150 μl/孔，室温震荡孵育5 min，酶标仪检测450 nm处的OD值。

1.6 Transwell 将各组MG-63细胞接种于Transwell小室上室(5×104个/孔)，加入含10%胎牛血清培养液600 μl于下室，37℃下孵育24 h后，用棉签擦去未穿膜细胞。多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。置于显微镜下随机选取5个视野计数。

1.7 Western blot 提取各组MG-63细胞总蛋白，BCA定量。进行SDS-PAGE后转移至PVDF上，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。

1.8 双荧光素酶报告基因实验 构建circ_0000069野生型、突变型荧光素酶表达载体WT-circ_0000069、MUT-circ_0000069，将其分别与miR-NC、miR-1182共转染至MG-63细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 circ_0000069和miR-1182在骨肉瘤组织中的表达 骨肉瘤组织中circ_0000069高于癌旁组织，miR-1182表达低于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 circ_0000069和miR-1182在骨肉瘤组织中的表达

2.2 敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染si-NC、si-circ_0000069至MG-63细胞后，si-circ_0000069组circ_0000069表达降低，MG-63细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达降低，p21表达升高(P<0.05)。见图1，表2、3。

图1 敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响；A 骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达

表2 敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表3 敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白的影响

2.3 circ_0000069靶向调控miR-1182的表达(Circinteractome Predicted) Circinteractome预测显示，circ_0000069的序列中含有与miR-1182互补的核苷酸序列。与转染miR-NC的WT-circ_0000069比较，转染miR-1182的荧光素酶活性降低(P<0.05)；过表达和沉默circ_0000069分别下调和上调miR-1182表达(P<0.05)。见图2，表4、5。

表4 双荧光素酶报告实验

图2 circ_0000069的序列中含有与miR-1182互补的核苷酸序列

2.4 过表达miR-1182对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染miR-NC、miR-1182至MG-63细胞后，miR-1182组miR-1182表达升高，MG-63细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达降低，p21表达升高(P<0.05)。见图3，表6、7。

表5 circ_0000069调控miR-1182表达

图3 过表达miR-1182对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响；A 骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达

表6 过表达miR-1182对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表7 过表达miR-1182对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

2.5 下调miR-1182逆转了敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响 共转染si-circ_0000069、anti-miR-NC与si-circ_0000069、anti-miR-1182至MG-63细胞后，si-circ_0000069+anti-miR-1182组miR-1182表达降低，MG-63细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达升高，p21表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4，表8、9。

图4 下调miR-1182逆转了敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响；A 骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达

表8 下调miR-1182逆转了敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表9 下调miR-1182逆转了敲除circ_0000069对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨论

circ_0000658在骨肉瘤组织和细胞系中低水平表达，沉默circ_0000658表达可促进骨肉瘤细胞周期进展、增殖、侵袭和迁移，抑制骨肉瘤细胞凋亡[10]。上调circ_0008792可抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭，促进细胞凋亡[11]。circ_HIPK3在骨肉瘤细胞系中稳定下调，circ_HIPK3表达与Enneking分期和肺转移显著相关，过表达circ_HIPK3在体外显著抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[12]。circ_0001785在骨肉瘤细胞系中高表达，敲除circ-0001785可降低骨肉瘤细胞的增殖能力，并诱导细胞凋亡[13]。circ_001621可促进骨肉瘤细胞增殖、迁移以及体内骨肉瘤转移[14]。在骨肉瘤细胞系和组织中，circ_001422表达显著增加，其高表达与晚期临床分期、肿瘤大小、远处转移和总体生存率显著相关，敲除circ_001422可抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移，并促进细胞凋亡[15]。circ_0005909高表达与骨肉瘤患者低生存率有关。干扰circ_0005909表达可抑制体内肿瘤生长，抑制体外骨肉瘤细胞的活力、集落形成、迁移、侵袭和EMT[16]。circ_0000282与骨肉瘤患者Enneking分期正相关，与肿瘤分化程度负相关，过表达circ_0000282可促进骨肉瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡[17]。与上述研究结果相似，本实验结果提示敲除circ_0000069可抑制MG-63细胞的增殖、迁移和侵袭。

研究表明，circ_0000069可作为竞争性内源RNAs吸附microRNAs，并调控其下游基因的表达[7]。本实验Circinteractome预测显示，circ_0000069与miR-1182 之间存在核苷酸结合位点，双荧光素酶报告基因实验结果显示，在WT-circ_0000069中，转染miR-1182的荧光素酶活性降低，且circ_0000069负调控miR-1182表达。研究表明。上调miR-1182可抑制宫颈癌HeLa细胞活力、迁移和侵袭能力[18]。过表达miR-1182可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、集落形成和侵袭能力[19]。miR-1182可抑制胃癌细胞的增殖和转移潜能[20]。据显示，miR-1182在卵巢癌组织中表达下调，上调miR-1182可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移能力[21]。本实验结果提示circ_0000069可能通过靶向调控miR-1182表达影响MG-63细胞的增殖、迁移和侵袭。与前人研究结果[18-21]一致。

综上所述，circ_0000069在骨肉瘤组织中高表达，敲减circ_0000069可能通过靶向上调miR-1182抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖、迁移和侵袭。circ_0000069可能是骨肉瘤的新治疗靶点。