circ_0000218靶向miR-1278调控肺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭

王静 邵小美 谭德伦

肺癌是较普遍的恶性肿瘤，是最常见的全球癌症相关死亡原因[1]。由于缺乏早期临床症状，大多数肺癌患者确诊时已为晚期，失去了最佳治疗时期。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常见的亚型，包括大细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌，约占肺癌的85%[2]。不良饮食、吸烟、职业暴露和遗传易感性是非小细胞肺癌的主要危险因素[3]。尽管临床治疗手段已取得一定进展，但NSCLC患者预后仍较差，5年生存率较低。耐药性、肿瘤转移等是治疗NSCLC的主要障碍[4]。因此，亟待研究NSCLC病理机制和寻找新的治疗策略。环状RNA(circRNAs)是一种新型单链非编码RNA转录本，具有序列保守、结构稳定、丰度高和特异性高等特点[5]。研究发现，沉默circ_0000218可抑制喉鳞状细胞癌细胞活力，促进细胞凋亡[6]。circ_0000218高表达与大肠癌T分期和局部淋巴结转移增加相关，下调circ_0000218可抑制大肠癌细胞的增殖和转移[7]。过表达circ_0000218可促进肾细胞癌细胞的增殖和转移[8]。下调circ_0000218可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭[9]。然而，circ_0000218在NSCLC中的作用笔者尚未见报道。Circinteractome预测显示，circ_0000218与miR-1278 之间存在核苷酸结合位点。有研究报道，miR-1278在肺癌细胞中低表达[10]。因此，本实验旨在研究circ_0000212在NSCLC中的作用以及其是否通过调控miR-1278表达影响NSCLC细胞H1299的增殖、迁移和侵袭。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2017年1月至2019年1月经病理检测为肺癌患者30例，获得原发性肺癌组织及相应癌旁组织，患者均知情且同意，手术切除后立即将样本保存在-80℃。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 材料 肺癌细胞株H1299购自购自中科院上海细胞库；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；Trziol、反转录、qRT-PCR试剂购自美国Thermo Fisher公司；MTT 试剂盒购自美国Sciencell公司；Transwell小室日本Chemicon公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；

1.3 细胞转染与分组 取对数生长期H1299细胞，将si-NC、si-circ_0000218、miR-NC、miR-1278分别转染至H1299细胞，记为si-NC组、si-circ_0000218组、miR-NC组、miR-1278组；将si-circ_0000218分别与anti-miR-NC、anti-miR-1278共转染至H1299细胞，记为si-circ_0000218+anti-miR-NC组、si-circ_0000218+anti-miR-1278组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，circ_0000218和miR-1278分别以GAPDH和U6为内参，相对表达量采用2-△△Ct法计算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 MTT 取各组H1299细胞(2.5×104个/ml)，接种于96孔板(100 μl/L)，培养48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔，培养4 h，弃上清，加入DMSO 150 μl/孔，室温震荡孵育5 min，酶标仪检测450 nm处的OD值。

1.6 Transwell 将各组H1299细胞接种于Transwell小室上室(5×104个/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培养液600 μl，在37℃下孵育24 h后，用棉签擦去未穿膜细胞。多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。置于显微镜下随机选取5个视野计数。

1.7 免疫印迹法(Western blot) 提取各组H1299细胞总蛋白，BCA进行定量。进行SDS-PAGE后转移至PVDF上，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。

1.8 双荧光素酶报告基因实验 构建circ_0000218野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-circ_0000218和MUT-circ_0000218，将其分别与miR-NC和miR-1278共转染至H1299细胞中，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响 H1299细胞中转染si-circ_0000218后，si-circ_0000218组circ_0000218表达水平降低，H1299细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平降低，p21表达水平升高(P<0.05)。见表1、2，图1。

图1 干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响；A 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达；B 肺癌H1299细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)

表1 干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.2 circ_0000218和miR-1278在肺癌组织中的表达 肺癌组织中circ_0000218高于癌旁组织，miR-1278表达水平低于癌旁组织(P<0.05)。见表3。

表2 干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白的影响

表3 circ_0000218和miR-1278在肺癌组织中的表达

2.3 circ_0000218靶向调控miR-1278的表达(Circinteractome Predicted) Circinteractome的数据预测显示，circ_0000218与miR-1278之间存在互补核苷酸序列。与转染miR-NC的WT-circ_0000218比较，转染miR-1278的荧光素酶活性降低(P<0.05)；circ_0000218靶向负调控miR-1278的表达(P<0.05)。见表4、5，图2。

表4 双荧光素酶报告实验

表5 circ_0000218调控miR-1278表达

图2 circ_0000218的序列中含有与miR-1278互补的核苷酸序列

2.4 过表达miR-1278对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响 H1299细胞中转染miR-1278后，miR-1278组miR-1278表达水平升高，H1299细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平降低，p21表达水平升高(P<0.05)。见表6、7，图3。

图3 过表达miR-1278对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响;A 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达；B 肺癌H1299细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)

表6 过表达miR-1278对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表7 过表达miR-1278对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

2.5 下调miR-1278逆转了干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响 H1299细胞中共转染后，si-circ_0000218+anti-miR-1278组miR-1278表达水平降低，H1299细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平升高，p21表达水平降低(P<0.05)。见图4，表8、9。

表8 下调miR-1278逆转了干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图4 下调miR-1278逆转了干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响；A 增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达；B 肺癌H1299细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色×200)

3 讨论

越来越多研究发现，circRNAs的异常表达与肿瘤进展密切相关。敲除circ_0003221可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，并诱导细胞周期阻滞[11]。上调circ0001686可促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[12]。干扰circ_0072088可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡[13]。过表达circ_0030586可抑制膀胱癌细胞的增殖和干细胞形成[14]。在甲状腺乳头状癌组织中，circ_0137287表达降低，其低表达预示着低生存率，上调circ_0137287抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭和有氧糖酵解，并诱导凋亡[15]。circ_0069244低表达与NSCLC患者生存期短和肿瘤组织学分级差有关，过表达circ_0069244抑制NSCLC细胞增殖和迁移[16]。与上述研究结果相似，本结果提示干扰circ_0000218表达可抑制H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

表9 下调miR-1278逆转了干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

研究表明，circ_0000218可作为竞争性内源RNAs吸附microRNAs，并调控其下游基因的表达[6-8]。本实验的Circinteractome预测显示，circ_0000218与miR-1278之间含有互补核苷酸序列，双荧光素酶报告基因实验结果显示，WT-circ_0000218中转染miR-1278的荧光素酶活性显著降低，且circ_0000218负调控miR-1278表达。众多研究发现，microRNAs与肺癌细胞的恶性生物学行为相关[17]。

有数据显示，miR-637作为一种肿瘤抑制因子，抑制NSCLC的细胞增殖、迁移和侵袭[18]。也有发现miR-486-5p在NSCLC组织和细胞中表达下调，上调miR-486-5p通过抑制上皮-间充质转化抑制NSCLC肿瘤的生长和转移[19]。在吉非替尼耐药NSCLC细胞中，miR-133a-3p表达明显下调，过表达miR-133a-3p增加了吉非替尼敏感性[20]。

miR-126-5p在NSCLC组织、顺铂耐药NSCLC组织和细胞中表达下调，过表达miR-126-5p抑制顺铂耐药NSCLC细胞增殖，促进细胞凋亡和增强细胞顺铂敏感性[21]。过表达miR-144-3p通过下调COL11A1表达抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[22]。

本实验结果显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中miR-1278表达降低；过表达miR-1278降低了H1299细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平，升高了p21水平。提示过表达miR-1278可抑制H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力。进一步研究发现，下调miR-1278逆转了干扰circ_0000218表达对肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响，H1299细胞的OD值、迁移、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平升高，p21水平降低。提示circ_0000218可能通过靶向调控miR-1278表达影响H1299细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，circ_0000218在肺癌组织中表达上调，干扰circ_0000218表达可能通过靶向上调miR-1278抑制肺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭。circ_0000218可能是新的治疗靶点，还有待进一步研究。