ICAM-1、MMP-9及NF-κB在胆管癌中的表达及与外周血免疫抑制细胞的关系

郑张军 张金星 张鑫

胆管癌是一种比较少见的消化道恶性肿瘤，主要来源于内肝胆管上皮细胞，其发病率逐年升高，因早期胆管癌不易发现，且容易转移与侵袭周围器官，故了解此病的转移机制进行早期干预对提高该病治疗效果具有重要意义[1]。研究表明，胆管癌的发生发展与肝内胆管结石有着密切关系[2]。随着对胆管癌的不断研究发现，此病的发展与多种细胞的因子异常表达相关，细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是介导细胞与细胞之间、细胞与细胞间质之间相互黏附并参与细胞间通讯的细胞膜表面分子，在肿瘤的黏附于转移中起着重要作用[3]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在多种恶性肿瘤中表达增强，与恶性肿瘤的浸润转移密切相关[4]。核转录因子(nuclear transcription factor，NF-κB)存在于细胞质中，在介导持续炎症与肿瘤关系中起着重要作用[5]。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)在多种脑肿瘤中表达增加，正常的外周血单个细胞接触胆管癌细胞后可呈现出MDSC特性且数量增加。基于上述研究背景，在本文研究中进一步验证ICAM-1、MMP-9、NF-κB在胆管癌中的表达，并分析其与外周血免疫抑制细胞的相关性，为临床上胆管癌的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年12月至2020年12月我院收治的60例胆管癌患者作为胆管癌组，男32例，女28例；年龄45～78岁，平均年龄(58.43±16.50)岁；肿瘤直径：>5 cm 15例，2～5 cm 24例，<2 cm 21例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ期27例，Ⅳ期14例；高分化31例，中低分化29例；淋巴结转移28例；肌层浸润深度：无肌层浸润或者浅肌层浸润(<1/2)24例，深肌层浸润(≥1/2)36例。同期选取60例于我院体检的健康人作为健康组，男30例，女30例；年龄46～79岁，平均年龄(59.38±16.50)岁。2组性别比、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本次研究所有研究对象知情同意，且签署了知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：胆管癌组患者符合《肝内胆管癌外科治疗中国专家共识(2020版)》[6]中对胆管癌患者的诊断标准；患者近3个月未使用过免疫抑制剂；临床资料完整。健康组无胆管癌疾病，体检正常。

1.2.2 排除标准：沟通障碍者；对本次研究不配合者；精神障碍者。

1.3 方法

1.3.1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB检测方法:取癌组织、癌旁组织制备为组织匀浆，采用ELISA法测定ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达水平。将试剂放于18℃～25℃的室温中待用，于反应板每个孔加入100 μl标准品和样品，室温静置25 h或者保持4℃轻微摇晃过夜，之后弃去孔中液体，用1×Wash Sohltion进行洗涤4次，每孔加入300 μl Wash bufer,后再全部清洗一次，最后一次清洗将孔中液体全部清除。每个孔加入100 μl提前准备好的1×Detation Antibody，室温下轻微摇晃1 h，之后弃去孔中液体，重复之前清洗方式，每个孔加入100 μl提前准备好的Streptavidin solution，室温下轻微摇晃45 min，之后弃去孔中液体，重复之前清洗方式，清洗过后每个孔加入100 μl TMB One-Step Substrate Reagent(Itern H)，室温下轻微摇晃30 min，之后在每个孔加入50 μl Stop Solution(Iterm I),立即在450 nm波长下检测，查出ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达水平。采用免疫组化检测胆管癌组织、癌旁组织标本ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达情况，将采集到的组织用PBS冲洗后放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12 h，脱水、透明、包埋后制作5～7 μm组织切片，将组织块放入50℃温水中展开，用处理干净的载玻片捞片，放入68℃恒温箱内烘烤2 h，在二甲苯中脱蜡浸泡25 min，之后浸在梯度乙醇各2 min，再用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。用80%甲醇孵育10 min，再用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。之后放入0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液中煮沸，自然冷却>20 min，之后用冷水冲洗加快冷却至室温，再用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。加入正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体。滴加一抗50 μl，室温静置1 h，取出后37℃复温45 min，用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗40～50 μl，室温静置1 h，用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。之后滴加SP，室温孵育30 min，用PBS冲洗2～3次，每次持续5 min。加入DAB显色5～10 min，显微镜下掌握染色程度，用自来水冲洗10 min终止反应。加入苏木素给予复染，盐酸乙醇分化后，使用自来水冲洗10～15 min，采用梯度乙醇进行脱水，用二甲苯冲洗片2～3次一直到透明，采用中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况。根据染色程度和染色细胞百分比进行评估：阳性细胞数<10%为(-)，10%～26%为(+)，25%～75%为(++)，>75%为(+++)。

1.3.2 外周血免疫抑制细胞检测:流式细胞仪检测免疫抑制细胞表达，分别采集2组空腹静脉血3 ml，加入100 μl抗凝全血，裂解后用不同荧光标记外周血免疫抑制细胞表面CD14+、CD11b+、HLA-DR-MDSC表达情况，选择HLA-DR-的细胞群为MDSC。

2 结果

2.1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB在癌组织、癌旁组织中的表达 与癌旁组织相比，癌组织中ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达均升高(P<0.05)。见表1。

表1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB在癌组织、癌旁组织中的表达

2.2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB与胆管癌演进的关系 ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达水平与胆管癌患者肿瘤直径无关，与TNM分期、分化程度、淋巴结转移、浸润深度表达相关，Ⅲ期、Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移、≥1/2肌层浸润胆管癌患者ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB与胆管癌演进的关系

2.3 外周血免疫抑制细胞在健康组、胆管癌组中的表达 胆管癌组外周血中MDSC比例高于健康健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 外周血免疫抑制细胞在健康组、胆管癌组中的表达

2.4 ICAM-1、MMP-9、NF-κB与外周血免疫抑制细胞相关性分析 ICAM-1、MMP-9、NF-κB、外周血免疫抑制细胞之间相关性分析，ICAM-1、MDSC之间呈正相关(r=0.597，P=0.001)，MMP-9、MDSC之间呈正相关r=0.585，P=0.001)，NF-κB、MDSC之间呈正相关(r=0.596，P=0.001)。见图1。

图1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB与外周血免疫抑制细胞之间相关性分析

2.5 ROC曲线分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC对胆管癌的诊断价值 ROC曲线显示，与ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC单项诊断相比，四项联合对胆管癌的预测价值较高(P<0.05)。见表4，图2。

表4 ROC曲线分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC对胆管癌的预测价值

图2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC诊断胆管癌的ROC曲线

3 讨论

胆管癌是一种恶性的消化系统肿瘤，临床症状并不明显，故发现时多为晚期，目前胆管癌发病机制尚不明确，其与肝胆管结石有着密切联系，我国的肝胆结石患者约有10%的概率发生胆管癌[7]。研究显示，胆管内结石反复刺激胆管壁、胆泥淤积及细菌感染反复引起胆管上皮损伤及增生修复，导致胆管上皮的不典型增生，诱发胆管癌[8,9]。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员，在免疫复合物的形成、抗原特异细胞毒性T细胞的识别、靶细胞的溶解中起着重要作用[10]。研究显示，ICAM-1表达于肿瘤细胞表面利于免疫效应的识别与肿瘤细胞的杀灭，肿瘤细胞及其他细胞产生的可溶性ICAM-1可有效阻断细胞毒性细胞黏附，抑制杀灭肿瘤细胞效应[11,12]。本文研究发现，胆管癌组织中ICAM-1水平高于癌旁组织，且随之疾病的演进不断升高，其原因可能为ICAM-1介导白细胞与肿瘤细胞黏附，导致原发细胞分离与癌细胞间黏附能力下降，此结果提示ICAM-1可能参与胆管癌的演进。

MMP-9是蛋白水解酶家族重要的一员，是由巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞合成分泌，可降解和破坏弹性纤维及纤维粘连蛋白，促进肿瘤的恶性演变，加强肿瘤细胞黏附能力，参与血管的形成，促进肿瘤的转移[13]。MMP-9在肿瘤组织中活性异常增高，对肿瘤浸润及转移起重要作用。临床研究表明，MMP-9的表达与肿瘤的病理分级与浸润有关，病理分级越高其表达越高，MMP-9在肿瘤中的高表达，是由某些生长因子的作用，MMP-9可降低肿瘤细胞之间的黏附性，提高其浸润与游走能力，导致恶性肿瘤的侵袭转移[14,15]。在本文研究中，胆管癌组织中MMP-9水平异常表达，且高于癌旁组织，表达水平与浸润深度显著相关，随着淋巴结转移增加，阳性表达率升高。

NF-κB是细胞内重要的转录因子，静息状态下以同源或异源二聚体的形式存在于细胞质中，细胞受到细菌感染等外源性刺激时与抑制蛋白剥离，进入细胞核其调控作用[16]。研究表明，NF-κB是连接炎症与肿瘤的中介因子，炎性因子形成的局部环境可促进NF-κB释放，过表达NF-κB可激活炎性因子的合成，形成恶性循环，使胆管上皮细胞发展成癌变[17,18]。本文研究结果表明，NF-κB在胆管癌中表达水平高于癌旁组织，且在疾病演进过程中的表达升高加剧，此结果提示着NF-κB与胆管癌病情存在一定联系。

MDSC可以限制肿瘤免疫的治疗效果，并参与肿瘤的免疫逃逸[19]。临床研究显示，CD14+的MDSC在多种实体肿瘤中表达升高，肿瘤可诱导MDSC引起的免疫抑制促进自身的免疫逃逸，去除肿瘤复合条件后外周血中MDSC比例下降，MDSC在多种肿瘤患者中表达增加，并与肿瘤的临床分期有关[20,21]。本文进一步分析发现，外周血免疫抑制细胞与ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达水平呈正相关，且ICAM-1、MMP-9、NF-κB与外周血免疫抑制细胞联合检测可提高胆管癌的预测价值。

另外本文采用分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB是否与胆管癌发生相关、ICAM-1、MMP-9、NF-κB与外周血免疫抑制细胞的关系，Logistic回归分析显示，ICAM-1、MMP-9、NF-κB与外周血免疫抑制细胞为胆管癌发生的危险因素，且ROC曲线显示，四项联合预测胆管癌的价值明显高于单项预测，提示着，临床上可根据上述指标表达情况早期评估此病。虽然本文发现四者与胆管癌相关，参与疾病演进，但并未深入分析其作用机制，因此还需后续研究进一步明确其参与演进的具体作用机制，为临床上此病的研究提供新方向。

综上所述，本文研究发现，胆管癌组织中ICAM-1、MMP-9、NF-κB表达升高，随着疾病的演进，表达升高加剧，参与疾病的演进，临床上可根据其表达预测此病。