CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在慢性阻塞性肺疾病合并肺气肿中的表达及相关性

柏发蕊 许栋

不可逆的气流限制是慢性阻塞性肺疾病(Chrinic obstructive pulimonary disease，COPD)主要病理特征，与肺对有毒粒子/气体的异常炎性反应相关[1]。研究表明，随着生活方式、环境的发展，COPD已成为导致死亡的主要病因，且其发病率、病死率趋于逐年升高，对社会健康造成严重威胁[2,3]。肺气肿作为常见影像学表现，已被认定是其重要表型。在COPD合并肺气肿发病过程中肺部产生异常炎性反应释放炎性介质，如白介素、C反应蛋白等，是评估炎性反应的常用评价指标，但缺乏可靠的预测诊断指标[4,5]。相关研究表明，血清不规则趋化因子(CX3CL1/FKN)作为跨膜糖蛋白，其生化特征、染色体定位等均表明其在白细胞向内皮细胞趋化的分子控制机制中发挥独特作用，而由Clara细胞分泌合成的Clara 细胞分泌蛋白(CC16)具有抗炎、免疫调节活性，是促进COPD发生、发展的重要因素[6,7]。有研究指出，GULP1作为调控凋亡细胞的吞噬关键蛋白，在COPD凋亡细胞清理缺陷中发挥重要作用[8]。基于此，通过检测COPD合并肺气肿患者血清CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达，了解COPD合并肺气肿发生情况及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取我院2019年1月至2021年1月收治的98例慢性阻塞性肺疾病患者为观察组，其中男52例，女46例；年龄45～73岁，平均年龄(59.00±11.90)岁；同期选取100例体检健康人员为对照组，其中男52例，女48例；年龄43～76岁，平均年龄(59.5±14.02)岁。按照是否合并肺气肿将观察组分为COPD患者43例，COPD合并肺气肿患者55例。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属知情并签署同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：符合《慢性阻塞性肺疾病基层诊疗指南(实践版·2018)》中COPD相关诊断标准[9]；均为稳定期COPD患者，经影像学检查确诊；健康人员身体健康无任何疾病。

1.2.2 排除标准：心肺、肝肾等脏器功能严重损伤者；合并基础疾病、免疫障碍、血液系统疾病者；合并恶性肿瘤者；既往有气管插管病史；合并影响呼吸系统的严重疾病者；近期内吸入/口服糖皮质激素者；长效应用抗胆碱能药物。

1.3 观察指标

1.3.1 肺功能检测:采用Master Screen肺功能仪检测用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in first second，FEV1)、FEV1/FVC%水平，均测量>3次，保留3次最佳数值，取其平均值。

1.3.2 血样采集:于接诊当日抽取所有受试者5 ml空腹静脉血，置于EDTA抗凝管中，离心处理10 min(转速：3 000 r/min，离心半径12 cm)，分离上清，于-20℃下低温保存。

1.3.3 CX3CL1/FKN、CC16含量测定:采用酶联免疫吸附法检测受试者CX3CL1/FKN、CC16含量，检测时酶标板分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，每孔内均加入50 μl稀释液，空白孔、标准孔、待测样品孔内分别加入样品稀释液、标准品、待测样片各 50 μl，轻晃均匀，酶标板覆膜，室温孵育2 h。孵育结束后弃孔内液体，甩干，采用洗涤液反复清洗反应板。每孔内加入CX3CL1/FKN、CC16检测液100 μl，重新覆膜，室温孵育1 h，弃孔内液体，甩干、洗涤反应板，每孔内加入100 μl底物溶液，室温避光显色30 min，加入50 μl终止液，轻弹酶标板终止反应。

1.3.4 GULP1表达测定:患者入院接受常规纤维支气管镜检查时，首先根据病情选择刷检部位，操作时利用一次性无菌细胞刷轻轻刷取气道上皮，将刷检下来的细胞收集于培养液中，离心洗涤后，将其配置为细胞悬液，并进行扩大培养，将细胞调制为所需浓度的细胞悬液用于检测。采用免疫组化SP染色法对受试者GULP1表达进行检测，脱蜡、水化等处理后，将其在0.01 mol/L、95℃的枸橼酸缓冲液中浸泡，并进行热修复，3% H2O2环境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃环境中培养30 min，抽离封闭液、添加一抗(鼠抗单克隆抗体GULP1，1∶1 000)，4℃过夜培养，PBS洗涤，加入二抗(鼠抗单克隆抗体β-actin，1∶5 000)，37℃恒温条件下孵育30 min，PBS洗涤，显色，苏木精复染后洗涤、脱水、透明、封片。采用双盲法阅片将GULP1蛋白阳性细胞所占总细胞比例分为4等级，阴性：<5%；弱阳性：5%～25%；中等阳性：26%～50%；强阳性：>50%，分别记为0、1、2、3分。每样本统计20个肺泡腔巨噬细胞数量，评价每个肺泡腔≥10个巨噬细胞为肺泡巨噬细胞高水平，<10个巨噬细胞为肺泡巨噬细胞低水平。

2 结果

2.1 2组患者肺功能指标比较 与对照组比较，观察组患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且COPD合并肺气肿患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平低于COPD患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组患者肺功能指标比较

2.2 2组患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达比较 与对照组比较，观察组患者CX3CL1/FKN、GULP1表达水平升高，CC16水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且COPD合并肺气肿患者CX3CL1/FKN、GULP1表达高于COPD患者，CC16水平低于COPD患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达比较

2.3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达与COPD合并肺气肿肺功能相关性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达进行相关性分析，结果显示CX3CL1/FKN、GULP1与COPD合并肺气肿FVC、FEV1、FEV1/FVC呈负相关(P<0.05)，CC16与COPD合并肺气肿FVC、FEV1、FEV1/FVC呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达与COPD合并肺气肿肺功能相关性分析

2.4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达与病情严重程度相关性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达进行相关性分析，COPD合并肺气肿患者CX3CL1/FKN、GULP1与病情严重程度呈正相关(P<0.05)，CC16与病情严重程度呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达与病情严重程度相关性分析

2.5 COPD合并肺气肿影响因素的多元Logistic回归分析 将COPD合并肺气肿发病(轻度=0，中重度=1)作为因变量，将 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1作为自变量，赋值升高设为1，正常设为0，纳入二分类多因素Logistic回归模型分析，结果显示，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1为影响COPD合并肺气肿发病的因素(P<0.05)。见表5。

表5 COPD合并肺气肿影响因素的多元Logistic回归分析

2.6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺气肿中的相关性分析 CX3CL1/FKN与CC16呈负相关(r=-0.597，P=0.001)；CX3CL1/FKN与GULP1呈正相关(r=0.712，P=0.001)；CC16与GULP1呈负相关(r=-0.702，P=0.001)。见表6。

表6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺气肿中的相关性分析

3 讨论

肺气肿作为COPD重要表型，主要由细支气管、肺泡壁弹性下降及过度膨胀破裂导致，可导致呼吸衰竭甚至死亡，严重威胁患者生命安全，故COPD诊断对预防COPD合并肺气肿具有独特意义[10]。

本研究指出，COPD合并肺气肿患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达高于COPD患者、健康者，提示CX3CL1/FKN、CC16、GULP1可能参与COPD合并肺气肿的发生发展。研究表明，炎性反应可促进COPD合并肺气肿的发展过程。CX3CL1/FKN作为常见炎性因子，可趋化、激活白细胞参与炎性反应的各个阶段，促进炎症发生，与肺部疾病的发展存在紧密关联[11,12]。相关研究表明，CX3CL1/FKN在COPD合并肺气肿患者血清中水平明显高于COPD患者，证实COPD合并肺气肿患者存在慢性炎性反应，导致大量炎性因子生产，对疾病进展造成影响[13,14]。CC16主要由Clara细胞分泌，具有气道保护、抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用，并参与肺部疾病发病的病理过程[15]。相关研究表明，在COPD小鼠气道中CC16免疫染色减少，并与肺部炎症、肺泡细胞凋亡、气道重塑存在显著关联[16]。相关研究指出，CC16可能参与COPD合并肺气肿的发生，对患者肺功能指标造成影响[17,18]。本研究证实CX3CL1/FKN、CC16参与COPD合并肺气肿发病的病理过程。GULP1已证实参与关节炎、精神分裂症及癌症等多种疾病发生发展，但临床中有关GULP1与COPD疾病进展的研究较少[19,20]。有学者指出，GULP1在COPD不同阶段肺组织支气管上皮细胞中表达存在差异，且与疾病严重程度呈正相关[21]。本研究表明，COPD合并肺气肿患者CX3CL1/FKN、GULP1高于COPD患者、健康者，CC16低于COPD患者、健康者，由此表明CX3CL1/FKN、CC16、GULP1参与COPD合并肺气肿的生理病理过程。同时研究证实CX3CL1/FKN、CC16、GULP1与肺功能指标变化及病情严重程度存在相关性，通过检测上述指标水平，可对COPD合并肺气肿发生风险进行早期预测，做好预防措施，从而改善COPD合并肺气肿发病率及病死率。

综上所述，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表达与肺功能指标、病情严重程度存在明显相关性，提示其表达变化能够有效COPD合并肺气肿的发生风险，对COPD合并肺气肿的预防具有重要裨益，有望成为评估COPD疾病诊断及预后的生物标志物，为COPD合并肺气肿提供新的临床途径。