妊娠期糖尿病患者肝脏激酶B1内含子380C＞T基因多态性与糖脂代谢的关系及评估疾病易感性的价值

钟新丽，朱红霞，刘星娅，曾凡英，李 思，李 英（成都市双流区第一人民医院，成都 610200）

妊 娠 期 糖 尿 病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期常见并发症，国外报道显示GDM发生率为1%～14%，国内GDM发生率为1%～5%[1-2]。GDM可增加不良母婴结局发生率，严重影响母婴健康，因此加强GDM的防治一直是临床研究的重点内容[3]。目前GDM的发病机制尚未完全明确，临床多项研究显示，糖脂代谢紊乱与GDM的发生发展密切相关，且是妊娠结局的影响因素[4-5]。有证据表明肝脏激酶B1（liver kinase B1，LKB1）在糖脂代谢调节方面具有重要作用[6]。相关研究[7]指出，LKB1基因内含子380C＞T及内含子459G＞A均存在基因多态性，其中内含子380C＞T的基因多态性与2型糖尿病的发病显著相关。但GDM患者是否存在LKB1内含子380C＞T基因多态性，目前尚无研究报道，为了明确LKB1内含子380C＞T基因多态性在GDM患病中的作用机制，本研究尝试探讨GDM患者LKB1内含子380C＞T基因多态性与糖脂代谢及GDM易感性的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 经成都市双流区第一人民医院伦理委员会审批通过，选取2019年1月～2021年4月成都市双流区第一人民医院收治的92例GDM患者作为GDM组，平均年龄32.02±3.15岁，孕前体质量指数23.87±1.15kg/m2，孕周26.03±1.22周，经产妇29例，有GDM家族史18例（19.57%）。依据1∶1对照设计原则，另选同期92例正常孕妇作为对照组，平均年龄31.78±3.69岁，孕前体质量指数23.59±1.30kg/m2，孕周25.89±1.05周，经产妇24例，有GDM家族史3例（3.26%）。两组年龄、孕前体质量指数、孕周、产史比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；GDM组有GDM家族史者占比高于对照组，差异有统计学意义（χ2=12.095,P＜0.01）。

纳入标准：（1）GDM组：①参照相关指南[8]诊断为GDM；②自然受孕、单胎妊娠；③孕24～28周；④无妊娠期高血压等其他妊娠期并发症；⑤自主行为能力良好，能配合完成研究；⑥患者及家属知晓本研究，已签署同意书。（2）对照组：①自然受孕、单胎妊娠；②孕24～28周；③无任何妊娠期并发症；④自主行为能力良好，能配合完成研究；⑤孕妇及家属知晓本研究，已签署同意书。

排除标准：①妊娠前糖尿病患者；②习惯性流产患者；③并发慢性高血压、高脂血症、内分泌代谢异常者；④严重心脑血管疾病患者；⑤肝肾功能不全者；⑥血液系统疾病患者；⑦传染性疾病患者；⑧恶性肿瘤患者。

剔除标准：①随访失访病例；②因病或意外死亡病例；③随访期间主动要求退出研究者。

1.2 仪器与试剂 E8000型全自动生化分析仪（德国罗氏公司），DNA快速提取试剂盒（徐州赛恩生物试剂有限公司），上游引物、下游引物（北京奥科生物技术有限责任公司），Taq DNA Polymerase High Fidelity试剂由Invitrogen供应商提供，ABI3730 XL全自动DNA测序仪（美国ABI公司）。

1.3 方法 采集所有研究对象入院当天空腹静脉血6 ml，取其中2 ml血液标本，采用E8000型全自动生化分析仪检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、三酰甘油（triglyceride，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）水平，检测操作严格按照说明书完成，并按照实验室常规做室内质控，若室内质控结果超出规定的失控限，则弃去实验结果，重新进行试验，实验室检验人员严格按照实验室标准操作程序的要求进行试剂定标、室内质量控制及研究样本的检测。课题相关数据录入时采用双录入方法，以确保所有数据的完整性和可靠性。取其中2 ml血液标本，采用DNA快速提取试剂盒提取全血DNA，随后采用荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对LKB1基因的rs741765（即380C＞T）位点进行基因多态性筛查，检索Genebank获得LKB1基因 的 核酸序 列，利 用Primer 5.0软件 设计380C＞T位点引物，上游引物：5'-GGA GAC CCC ACC CTC AAG C-3'，下游引物：5'-CTG AAA GGT GGG AGC CTC ATC-3'。采用PCR反应扩增试剂盒（润德生物科技公司）进行基因扩增，反应体系25 μl（模板DNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，PCR扩增试剂12.5 μl，灭菌纯水8.5 μl）。扩增条件如下：95 ℃10 min，94 ℃15 s，60 ℃60 s，40个循环。琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外投射反射仪中观察结果，分子量标准为100 bp DNA Marker 1，有PCR扩增产物存在的位置呈现橙红色荧光条带，以扩增产物长度鉴定基因型。将PCR扩增产物及上、下游引物送检测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对确认(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，以验证目标位点的基因型。

1.4 统计学分析 数据处理采用SPSS22.0软件，计数资料以例数描述，采用χ2检验。计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且服从正态分布，以均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Spearman相关系数模型。通过Logistic进行多因素回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组糖脂代谢指标水平比较 见表1。GDM组FPG，HbA1c，LDL-C，TG和TC水平较对照组高，HDL-C水平较对照组低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

表1 两组糖脂代谢指标水平比较（n=92，±s）

表1 两组糖脂代谢指标水平比较（n=92，±s）

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2.2 两组LKB1内含子380C＞T基因多态性比较两组基因型和等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，具有人群代表性（P＞0.01）；GDM组LKB1内含子380C＞T基因型CC，CT，TT基因型频率分别为41.30%（38/92），40.22%（37/92），18.48%（17/92），对 照 组 分 别 为59.78%（55/92），27.17%（25/92），13.04%（12/92），两组LKB1内含子380C＞T基因型CC，CT，TT频率分布比较，差异有统计学意义（χ2=6.292，P＜0.01）。

2.3 不同基因型患者糖脂代谢指标比较 见表2。不同LKB1内含子380C＞T基因型患者FPG，HDL-C，TG，TC水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；LKB1内含子380C＞T基因型TT患者HbA1c水平高于CT，CC型患者，基因型CT患者高于基因型CC患者，多组数据的两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；LKB1内含子380C＞T基因型TT，CT患者LDL-C水平均高于CC型患者，差异有统计学意义（均P＜0.01）。

表2 不同基因型患者糖脂代谢指标比较（±s）

表2 不同基因型患者糖脂代谢指标比较（±s）

注：与基因型CC比较，aP＜0.05；与基因型CT比较，bP＜0.05。

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2.4 HbA1c，LDL-C与基因型关系 以不同基因型患者HbA1c，LDL-C水平为Y轴，以基因型为X轴，应用Spearman分析显示，HbA1c水平与基因型呈强正相关（r=0.815，P=0.000）；LDL-C水平与基因型呈弱正相关（r=0.366，P=0.000）。

2.5 GDM易感性的多因素分析 见表3。因变量：无GDM=0，有GDM=1；自变量：GDM家族史（无=0，有=1）、基因型（CC=1，CT=2，TT=3）；应用多因素Logistic回归方程分析显示，有GDM家族史孕妇发生GDM风险可能是无GDM家族史孕妇的2.744倍（95%CI: 2.51～2.99），基因型TT孕妇发生GDM风险可能是基因型CC孕妇的3.394倍（95%CI: 3.07～3.76）（均P＜0.01）。

表3 GDM易感性的多因素Logistic回归方程分析

3 讨论

3.1 GDM影响因素 资料显示，遗传因素是GDM患病的主要病因之一[9-10]。本研究结果显示，GDM患者中有GDM家族史者明显多于正常孕妇，且多因素分析发现有GDM家族史孕妇发生GDM风险可能是无GDM家族史孕妇的2.744倍。因此对于存在GDM家族史的孕妇应加强GDM预防干预。

3.2 GDM糖脂代谢情况 本研究还发现，GDM患者FPG，HbA1c，LDL-C，TG和TC均高于正常孕妇，HDL-C低于正常孕妇，与孙振凤等[11-12]研究结果一致，说明GDM患者明显的糖脂代谢异常。其原因在于GDM患者体内存在胰岛素抵抗，由于胰岛素的生物调节作用发生障碍，导致血糖代谢紊乱，同时脂肪组织分泌大量的脂肪因子参与糖脂代谢及胰岛素的信号传导，胰岛素抵抗也会引起脂质代谢出现异常，最终引起糖脂代谢指标异常[13]。

3.3 LKB1基因多态性与GDM糖脂代谢 研究表明，通过筛查GDM易感基因，及早发现高危人群，有助于GDM的防治[14-15]。CHEN等[16]研究指出，LKB1基因能直接激活AMPK，参与葡萄糖代谢和胰岛素抵抗的调节，与糖尿病的发生发展相关。本研究结果显示，GDM患者的LKB1内含子380C＞T基因型中CT及TT基因型占比明显高于正常孕妇，提示GDM患者的LKB1内含子380C＞T基因存在明显基因多态性。LKB1基因是一种肿瘤抑制基因，位于人类19号染色体，包含10个外显子区域，其编码的433个氨基酸残基组成的丝氨酸/苏氨酸激酶即为LKB1，其能通过促进细胞凋亡、促进细胞极化等多方面抑制肿瘤的发生，还可通过激活AMP活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路信号最终抑制前脂肪细胞的成脂性分化，AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由催化亚基α和调节亚基β和γ组成，且是细胞内的能量监测器，对整个机体的能量调节过程有重要的作用，其能感知细胞能量状态的改变，被激活后可以关闭消耗ATP的路径，同时开启生成ATP的路径，在外周组织如肝脏和肌肉内，AMPK可以抑制脂肪酸和胆固醇的合成，抑制糖异生，还可以抑制脂肪组织内脂肪酸的合成[17]。因此LKB1基因的突变可参与脂代谢的调节。此外，有文献显示LKB1-AMPK-TORC2是调节肝脏糖异生的重要通路，LKB1的复合物是AMPK的上游激酶，胞浆内的复合物可活化AMPK从而调节糖脂代谢[18]。提示LKB1的异常表达可能参与机体糖脂代谢，但其在GDM发生发展中的作用尚无相关研究。且本研究通过相关性分析发现LKB1内含子380C＞T基因的基因型与HbA1c及LDL-C水平存在不同程度相关性，说明其基因多态性与GDM患者的糖脂代谢指标密切相关，可能在GDM糖脂代谢的发生发展中发挥调节作用。有报道指出LKB1在AMPK活化中具有不可缺少的作用，LKB1催化区域的突变将导致其激酶活性丧失，削弱其对AMPK的磷酸化作用，最终促进糖脂代谢的异常，引起血糖、血脂含量增加[19-20]，从而促进GDM的发生。本研究进一步通过多因素分析，发现LKB1内含子380C＞T基因型TT是GDM易感性的独立危险因素，证实了上述分析的正确性。

3.4 小结 综上可知，LKB1内含子380C＞T基因突变可通过引起机体发生糖脂代谢紊乱，从而增加GDM患病风险，是GDM发生的危险因素之一。但本研究仍存在一定局限性，如受条件限制未对LKB1内含子380C＞T基因多态性与和胰岛素抵抗的相关性进行研究分析，未来研究中将进行深入探讨，进一步发掘其在GDM发生发展及防治中的作用。