基因内含子遗传变异与鸭蛋壳品质关联性分析

谭光辉 李杰章 吴磊 覃媛钰 张依裕

摘要：

Ca2+調控基因ITPR

2是细胞内一种重要的配体门控，钙离子跨膜转运活性的关键调控因子，影响钙蛋壳的品质，对ITPR

2基因多态性与蛋壳品质间的关联性角度进行深入探究，旨在为利用该基因指导蛋鸭的遗传育种提供参考。本文以三穗鸭（Anas platyrhyncha domestica）为材料，采用常规PCR、直接测序等方法筛查ITPR2基因多态性。结果显示：在ITPR2基因中共发现4个SNP位点，分别处于内含子10的g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A，以及内含子14的g128659401 T>G，4个SNP位点中g128643840 G>A和g128643903 G>A 位点三穗鸭群体中基因型分布均显著偏离哈代温伯格平衡（Hardy-Weinberg平衡）（P<005）。4个SNPs均对蛋壳品质有显著影响，其中g128643840 G>A、g128643903 G>A及g128659401 T>G位点能显著提高蛋壳强度（P<005），g128643840 G>A位点显著影响蛋黄色泽（P<005）。研究结果可作为蛋壳品质遗传育种的参考。

关键词：ITPR2基因;SNPs;三穗鸭;蛋壳品质;内含子

中图分类号：S83489文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）02-0040-06国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.006The Relationship Between Genetic Variation of ITPR

2 Gene Intron and Duck Eggshell Quality of

Anas platyrhyncha domestica

TAN Guanghui ，LI Jiezhang ，WU Lei ，QIN Yuanyu，ZHANG Yiyu*

（Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，West Campus，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：The Ca2+ regulatory gene ITPR

2 is an important ligand-gated gene in cells，and a key regulator of calcium ion transport activity across the membrane，which affects the quality of calcium eggshells An in-depth study on the correlation between ITPR2 polymorphism and eggshell quality was conducted in order to provide reference for the use of this gene to guide the genetic breeding of egg ducks In this paper，the ITPR2 gene polymorphism of A.platyrhyncha domestica was screened by routine PCR and direct sequencing The results showed that four SNP loci were found in ITPR2 gene，including g128643840 G > A，g128643903G > A and g128643906 G > A of intron 10，g128659401 T > G of intron 14，and the genotype distribution of g128643840G > A and g128643903 G > A of four SNP loci deviated significantly from Hardy-Weinberg equilibrium （P<005） Four SNPs had significant effects on the quality of eggshell Among them，g128643840 G > A，g128643903 G > A and g128659401 T > G loci significantly increased the strength of eggshell （P<005），and g128643840 G > A loci significantly affected the yellow color of eggshell （P<005） The results can be used as a reference for genetic breeding of eggshell quality

Keywords：ITPR2 gene; SNPs;

Anas platyrhyncha domestica; eggshell quality; introns

蛋壳可固定蛋形状，保护蛋白、蛋黄以及维持内部环境的稳定，同时能防止微生物从外界进入蛋壳内，还能满足胚胎发育所需的部分营养物质。蛋壳质量通常影响蛋的孵化、运输、保存以及蛋制品的深加工等，影响着禽蛋产业的发展和人类的健康，其破损率的增加会给禽蛋产业带来巨大的经济损失，因此，蛋壳质量在整个蛋品质中有着非常重要位置。众多研究显示，钙是构成蛋壳的重要成分，并且决定蛋壳的脆性，在蛋壳总质量中钙占绝大部分，

蛋壳形成时

其钙沉积量直接由子宫部钙结合蛋白（calcium binding protein，CaBP）的表达量来决定[13]。由此可见，蛋壳质量的好坏与Ca2+调控基因有着直接的联系。

IP3Rs是对第一信使IP3（1，4，5-三磷酸肌醇）应答的一种普遍存在的细胞内钙离子（Ca2+）释放通道，在细胞内作为一种重要的配体门控参与胞质内Ca2+水平的精确调控;IP3与特异性受体IP3R结合后介导经由IP3R通道的胞内钙释放，在调节多种生物细胞功能活动如受精、细胞增殖、新陈代谢、分泌、平滑肌舒缩、神经信号传递和细胞凋亡等中发挥重要作用。ITPR2基因是IP3Rs的一种亚型，Ca2+是影响蛋壳品质的重要因素，以这方面来看ITPR2基因与蛋壳品质之间应该存在着相应的联系[46]。此外，已有研究表明，ITPR2基因通过调控钙离子来影响鸡的蛋壳品质

[710]，因此从ITPR2基因的多态性、表达与蛋壳品质关联性的角度进行深入的探究，具有一定的意义。本文以产蛋高峰期的三穗鸭为试验材料，

探讨蛋鸭ITPR2基因的多态性与蛋壳品质之间的关系，为今后利用该基因进行

三穗鸭育种提供参考，生产出品质更高的鸭蛋产品。

1材料与方法

1.1试验材料

三穗鸭（Anas platyrhyncha domestica）60只，三穗鸭种蛋购于三穗县，在三穗县养殖合作社孵化后转到贵州大学水禽养殖场同等饲养管理条件、健康无病、单体笼饲养，定期采集鸭蛋（编号与鸭翅号相同），用于蛋壳品质测定，提取每只鸭血样采血1 mL，用于DNA提取。

1.2蛋壳品质的测量

参照文献[11]描述方法进行蛋壳品质测量。

蛋重和蛋壳重：洗净鸭蛋上鸭粪等污染物后用电子天平（型号为BL-320H，购自日本岛津公司）称量，得到蛋重单位为

g;去除蛋黄和里面的一些残留蛋液称量蛋壳重量，单位为g。

蛋形指数：用购自武汉道简贸易有限公司的游标卡尺测量鸭蛋的长径和短径，精确到0.1 mm，长径/短径得到蛋形指数。

蛋壳厚度：北京天翔飞域仪器设备有限公司型号ETG-1061蛋壳厚度测定仪分别测定锐端、钝端和侧面的蛋壳厚度，取3个值得平均数得到蛋壳厚度，精确度0.01 mm。

蛋壳强度：蛋壳强度是蛋壳致密坚固性指标，指对蛋碰撞和挤压的承受能力。用蛋壳强度测定儀（型号为EFR-01，购自北京天翔飞域仪器设备有限公司）测定，单位为N/cm2。

1.3血液基因DNA的提取、引物的设计

根据QlAamp DNA Mini Kit（50）DNA （北京擎科）提取试剂盒提取全部个体血样DNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，核酸浓度检测仪检测DNA的OD值及浓度。参照NCBI数据库中鸭

ITPR2基因DNA序列（登录号：NC_040046.1），利用软件primer 5.0对

ITPR2基因共设计3对多态引物ITPR2-F1/R1（F1：GAAGGTGGGAAGCTGTGTGT，R1：AGAGGCCACCAGCAGTAGAA，片段长520 bp）、ITPR2-F2/R2（F2：CAGGACTTCCCACCTGTTGT，R2：CTCCCTTTCTCCATGCTCTG，片段长523 bp）、ITPR2-F3/R3（F3：TCAATGCTGAGACTTGAAGACC，R3：GCTGTGATGGTGTCTTCTGC，片段长1121 bp）分别用于扩增鸭ITPR2基因g128643717～

g.128644237、g.128644900～g.128645423和g.128659269～g.128660388区域，3对引物退火温度均为62℃，引物由上海

生物工程有限公司合成。

14PCR扩增程序

试验选取2×Taq PCR Master Mix试剂进行目的基因的PCR扩增，扩增产物置于4℃冰箱中保存，PCR反应体系（20SymbolmA@L）和扩增程序如表1所示。采用15%的琼脂糖凝胶，在120 V电压、100 mA电流的条件下电泳30 min后检测目的片段。检测有目的条带的产物送

上海

生物工程有限公司进行测序。测序结果采用DNAStar软件和MegAlign程序进行初步筛选SNP位点。根据SNP位点，以个体DNA为模板，选用相应的引物进行PCR扩增，扩增产物送往上海生物工程有限公司进行测序分型。

15数据处理

用Excel 2013对各多态位点的基因型以及蛋品质测量数据进行统计，运用SHEsis在线软件（http：//analysisbio-xcn/）计算基因型频率、等位基因频率、单倍型频率、基因型分布卡方值（

SymbolcA@2）、连锁不平衡的D 和SymbolgA@2值;PopGen32 V131软件计算观察杂合度（

He）、有效等位基因（Ne）、和多态信息量（PIC）;SPSS 180软件中的一般线性模型对多态位点与蛋品质的关联性进行分析，结果采用平均值±标准误表示。

2结果与分析

21基因组DNA提取效果和引物特异性检测

用15 %的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明（图1），DNA条带清晰、整齐、无杂带，效果良好。用紫外分光光度计检测DNA的OD260/OD280处于18～20之间，说明提取的DNA纯度高，可用于下一步试验;PCR扩增三穗鸭ITPR2多态引物结果见图2，3对引物的PCR产物条带大小与预设片段相同，条带清晰明亮，可用于该基因多态性分析引物。

22三穗鸭ITPR2基因多态性检测

利用Editseq和MegAlign程序对测序结果与GenBank中原始序列进行对比分析，结合测序峰图（在Chromas转件中打开）查找鸭ITPR2基因g128643717～ g128660388区域SNPs，发现在3对引物扩增的目的片段中发现4个SNP位点（图3），分别是ITPR2内含子10的g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A，以及內含子14的g128659401 T>G，4个SNPs均只产生两种基因型，内含子属于非编码区域，不编码蛋白，所以对氨基酸序列没有影响。

23三穗鸭ITPR2基因多态位点遗传特性分析

通过对

ITPR2基因的4个SNP位点进行遗传特性分析显示（表2）：g128643840

G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A 3个SNPs优势等位基因型均为杂合型GA，其优势频率分别为0767、0617、0833，优势等位基因均为G，其频率分别是0617、0692、0583，并且3个SNP位点均属于中度多态（025<

PIC<05）;而g128659401 T>G位点优势等位基因型为纯合子TT频率为0750，优势等位基因T频率0875，属于低度多态（PIC<025）;4个SNP位点中g128643840 G>A和g128643903 G>A 位点三穗鸭群体中基因型分布均显著偏离哈代温伯格平衡（Hardy-Weinberg平衡）（

P<005），而g128643906 G>A和g128659401 T>G位点在三穗鸭群体中基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P>005）。

24三穗鸭ITPR

2基因SNPs与蛋品质关联性分析

运用SPSS 180软件中的一般线性模型分析三穗鸭ITPR2基因4个SNPs不同基因型对蛋品质的影响，结果显示（表3）：g128643840 G>A和g128643903 G>A位点GA基因型以及g128659401 T>G位点基因型TT的蛋壳强度显著大于其它基因型（P<005）;g128643903 G>A位点GA型与g128659401 T>G位点TT基因型的蛋壳厚度显著高于其它基因型（P<005）;g128643840 G>A位点GG和GA基因型蛋黄色泽显著高于其他基因型（P<005）。

3结论与讨论

蛋壳品质是衡量蛋禽生产性能好坏的一个重要指标，影响蛋壳质量的因素有很多，如日粮中的钙、磷、锌、锰、维生素D

3等，其中钙对蛋壳质量的影响尤为显著[12]。蛋壳主要是在家禽的子宫部（蛋壳腺处）形成，其钙化过程发生于非细胞结构的子宫液（含充足的Ca2+）中[13]。早关于蛋壳质量的影响因素的研究大多集中在饲养方式和饲喂水平等宏观调控，随着生产者和消费者关注度的提升，对蛋壳质量的研究逐渐从宏观调控，转向影响蛋壳形成的内源直接因素的调控，即分子遗传育种的方法，通过基因表达调控蛋禽输卵管和子宫内与蛋壳形成相关物质的表达量，将为改善蛋壳质量提供新的技术手段。FUJINO等[14]研究报道，ITPR

2基因可能对颌下腺内管细胞、肾小管细胞、附睾导管上皮细胞和卵巢滤泡颗粒细胞等的分泌功能具有调控作用。FUKUDA等[15]通过研究小鼠侧鼻腺（LNG）腺泡细胞表明，

ITPR2和

IP3R3

基因介导鼻腔粘液分泌，影响鼻组织的维持以及气味的感知。YUE等[16]研究表明，功能性ITPR

2在小鼠存储区域网络中表达，并可作为一种额外的钙依赖机制来调节心脏起搏器活动以及其他与钙相关的过程。

AKIMICHI等[17]提出，ITPR

2可能通过对肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的凋亡和钙库操纵性钙内流（SOCE）的影响，在肺动脉高压（PAH）的病理生理学中发挥抑制作用。目前关于ITPR

2基因的研究大多集中在人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus），但其对鸭（Cairina moschata）蛋壳品质调效应影响尚未见相关报道。

在三穗鸭ITPR

2基因内含子检测到4个SNP位点，均只产生两种基因型，可能与试验样本数量较少有关或三穗鸭群体在多年的人工选择或自然选择过程中，导致另一种基因型消失;3个SNPs遗传特性分析显示，g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A均属于中度多态，表明试验群体具有持续选育提高的可能性和必要性，可作为分子标记辅助选择的潜在分子标记位点，对蛋鸭蛋壳品质改良提供了分子基础。Hardy-Weinberg平衡检验发现g128643840 G>A和g128643903 G>A 位点偏离Hardy-Weinberg平衡，揭示这2个SNP位点可能受到突变、选择、遗传漂变等的影响，

或是受到长期的人工选择的影响，但是更精确的遗传多样性评价可能需要结合更多的鸭样本[18]。先前的研究证明，内含子虽然不会造成对应氨基酸的改变，但是它们可能会反复改变调控剪接的外显子基序，如果这些突变位点与剪接位点相邻可能导致剪接位点失活，而且单核苷酸的替换会改变mRNA的剪切效率或准确性，从而影响蛋白质的功能、构象和表达水平的变化[19]，因此内含子突变在遗传育种中也是不可忽略的。关联分析结果显示，4个内含子SNPs不同基因型均对鸭蛋壳品质具有不同程度的影响，其中g128643840 G>A和g128643903 G>A及g128659401 T>G位点能显著提高蛋壳强度，推测这3个SNPs可能是ITPR

2基因生物功能发挥的调控位点，其单核苷酸的改变可能影响了该基因对钙离子释放作用，进而调控蛋壳品质。而蛋壳强度是评价蛋壳之间最直接的体现，因此这2个SNPs对蛋壳品质的调控可能更加有效;另外g128643840 G>A位点显著影响蛋黄色泽，前人研究表明，蛋黄色泽较好的蛋壳质量较高[20]，而且较好蛋黄色澤更能

得到消费者的喜欢，因此g128643840 G>A位点GG和GA基因型认为是有利基因型，但在实际生产中，蛋壳强度过高的蛋壳不一定都是有利的，过高蛋壳强度可能影响幼雏的孵化率，影响生产效益，所以需根据生产需求而选择培育。

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