特发性肺动脉高压患儿血清miR-182和ICAM-1表达水平及其与预后相关性分析

杨春光，刘海红，王凤东，王晓静，张学郁，张海波

（承德市妇幼保健院 a.新生儿科；b.检验科；c.儿科，河北承德 067020）

特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）成人发病率为15～50例/100万人/年，无特异性临床症状，易引起右心功能衰竭甚至死亡[1-2]。相较于成人，儿童处于生长发育状态，肺血管生理和病理改变更加特殊，IPAH患儿的肺动脉压力、肺血管阻力和心脏指数升高更明显，预后更差，未经治疗者平均存活时间仅为10个月，1，3，5年生存率分别为89%，84%和75%[3]。目前认为IPAH可能与遗传多态性、多基因缺陷、细胞因子和生长因子分泌异常有关[4-5]。微小核糖核酸（micro RNA，miR）-182对细胞增殖、分化和凋亡等生物效应具有关键的调控作用，与肺癌关系密切[6]。细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达于血管内皮细胞、气道柱状上皮细胞及肺泡上皮细胞表面，主要作用是介导细胞黏附、参与免疫应答和调节炎症反应[7]。既往研究[8]显示，微小核糖核酸（micro RNA）miRNA可能通过某种机制对ICAM-1表达产生影响。本研究旨在探究血清miR-182和ICAM-1在IPAH患儿中的表达及对患儿预后的预测价值，以期为临床诊治、改善IPAH患儿预后提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年6月～2020年12月就诊于承德市妇幼保健院肺动脉高压中心的76例IPAH患儿为研究对象（观察组），其中男性45例，女性31例；年龄1～10（5.63±4.26）岁。纳入标准：①诊断均符合PAH指南[9]；②超声心动图检查估测肺动脉收缩压（systolic pulmonary artery pressure，sPAP）＞36 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）；③静 息状态下右心导管检查肺毛细血管楔压（pulmonary capillary wedge pressure，PCWP）≤15mmHg，肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）＞3 Wood·U，肺动脉平均 压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞25 mmHg；④均具备用药指征；⑤患儿监护人对本研究均知情同意并签字确认。排除标准：①诊断为先天性心脏病、结缔组织病相关性PAH者；②由原发肺部疾病或肺栓塞及其他原因引起的PAH者；③并发严重的肝肾功能不全者；④中途转院或放弃治疗者；⑤存在用药禁忌证者。另选取同期在医院进行体检的健康儿童30例作为对照组，其中男性18例，女性12例；年龄1～9（5.27±3.82）岁。两组一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 仪器与试剂 SpectraMax M5多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；miR-182，ICAM-1试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方案：参照儿童PAH指南[10]给予治疗。

1.3.2 血清miR-182，ICAM-1检测：抽取健康对照组儿童及IPAH患儿入院24h内的外周静脉血3 ml，离心收集上层血清。以U6为内参，提取血清总RNA，反转录cDNA，PCR共进行40个循环，重复三次，采用2-ΔΔCt法计算血清miR-182相对表达水平。miR-182上游引物：5'-GCGCGTGGTTCTAGA CTTGC-3，下游引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTC CGAGG-3'；U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACA TATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3'，均由上海生工生物工程有限公司合成。采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）测定血清ICAM-1水平。

1.3.3 随访及预后分组：随访至2021年12月，主要以电话、微信及门诊等形式进行，记录终点事件（随访终点为全因死亡或接受肺移植术）[10]，根据终点事件发生与否将所有入组患儿分为存活组和死亡组。

1.3.4 资料收集：收集IPAH患儿的相关临床资料，包括性别、年龄、体重、临床症状（青紫、晕厥、咯血、水肿）、P波高尖、NYHA心功能分级、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、尿酸（uric acid，UA）、总胆红素（total bilirubin，TB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、红细胞分布宽度（red cell volume distribution width，RDW），sPAP，mPAP，全肺阻力（total pulmonary resistance，TPR）、肺血管 阻 力 指 数（pulmonary vascular resistance index，PVRI）、心脏指数（cardiac index，CI）、经皮血氧饱和度、三尖瓣反流速率、左心室舒末径、X线心胸比、治疗方案（单药治疗、双药联合治疗、三药联合治疗）、血清miR-182和ICAM-1水平。

1.4 统计学分析 应用SPSS26.0统计软件处理数据。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料经正态分布和方差齐性检验后采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，若方差不齐，则采用t'检验；预测效能分析采用ROC曲线，获取曲线下面积、95%可信区间、敏感度、特异度及cut-off值，不同预测方案间曲线下面积（area under curve，AUC）比较采用DeLong检验，联合诊断实施Logistic二元回归拟合，返回预测概率logit(p)，将其作为独立检验变量。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组与对照组血清miR-182，ICAM-1水平比较 观察组血清miR-182（1.91±0.20），ICAM-1（305.67±32.46 ng/ml）水平均高于对照组（0.15±0.02，203.22±21.51 ng/ml），差异具有统计学意义（t'=-73.624，-33.698，均P＜0.001）。

2.2 随访结果 对76例IPAH患儿进行随访，共获得72例随访结果，总体随访率为94.74%，失访4例，失访率为5.26%；获得随访的72例IPAH患儿死亡21例（29.17%），其中因感染、腹泻等所致右心衰竭死亡15例（71.43%），因大咯血窒息死亡6例（28.57%），存活51例（70.83%）。

2.3 存活组与死亡组IPAH患儿临床资料比较 见表1。死亡组NYHA心功能分级（高级）占比、BNP，TB，RDW，sPAP，TPR，miR-182，ICAM-1水平均高于存活组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；两组性别、年龄、体重、临床症状、P波高尖、UA，LDH，mPAP，PVRI，CI，经皮血氧饱和度、三尖瓣反流速率、左心室舒末径、X线心胸比、治疗方案比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 存活组与死亡组IPAH患儿临床资料比较[±s, n（%）]

表1 存活组与死亡组IPAH患儿临床资料比较[±s, n（%）]

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2.4 影响IPAH患儿预后的多因素Logistic回归分析 见表2。多因素Logistic回归分析显示，NYHA心功能分级（高级）、RDW，sPAP，miR-182，ICAM-1是影响IPAH患儿预后的危险因素（P＜0.05）。

表2 影响IPAH患儿预后的多因素Logistic回归分析

2.5 血清miR-182，ICAM-1对IPAH患儿预后的预测价值 见表3，图1。血清miR-182，ICAM-1预测IPAH患儿预后有较高的敏感度和特异度，同时联合检测的效能高于独立检测（Z=-3.236，P=0.012；Z=-3.211，P=0.009）。

表3 血清miR-182，ICAM-1对IPAH患儿预后的预测价值

图1 血清miR-182，ICAM-1对IPAH患儿预后的预测价值

3 讨论

目前研究认为特发性肺动脉高压（IPAH）发病机制主要与细胞、体液介质、分子遗传等多个因素有关[11]。肺血管系统较复杂，易受多种血管活性物质影响，如血管紧张素Ⅱ、血栓素A2等能使肺循环微动脉收缩，心房利钠肽、一氧化氮等可使肺血管舒张，上述血管介质一旦失衡就易引发IPAH[12]。相关资料[13]显示，大部分IPAH患者的血清炎症细胞因子呈现异常高表达，且免疫指标（如抗核抗体）为阳性，并具有免疫系统疾病特有的雷诺现象，推测免疫炎症紊乱可能参与了IPAH的发病机制。国外报道儿童IPAH发病率为10例/100万，但该病起病隐匿，患儿症状差异较明显，临床诊断难度较大，极易导致漏诊和误诊[5]。故寻找安全高效的血清学诊断或预后预测指标尤为重要。

在本研究中，IPAH患儿血清miR-182和ICAM-1水平明显高于健康儿童，提示血清miR-182和ICAM-1水平在IPAH患儿中呈现异常高表达，上述指标可能与IPAH发病机制有关，临床诊断或治疗中需要给予重点监测。miR-182通常被认为是原癌基因在肿瘤的高表达，并促进肿瘤细胞增殖，例如miR-182在乳腺癌中高表达，通过靶向叉头蛋白F2促进肿瘤细胞增殖和迁移；在结肠癌中高表达，通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路维持肿瘤细胞的干细胞状态；在胶质瘤中高表达，通过靶向果糖-2,6-二磷酸酶2提高肿瘤细胞增殖及侵袭能力[14-16]。近年来大量临床研究或基础研究均表明，miRNA在心血管系统信号网络调控中起到重要作用，参与IPAH中血管收缩和重构中多物质的调控[17-18]。此外，研究者发现还有更多的miRNA在IPAH患者中存在异常表达，但迄今为止，仅有数种miRNA被通过实验证明确实在IPAH的发生、发展中发挥一定的作用。目前研究显示，IPAH患者miRNA表达谱中共有78个差异表达位点，其中62个显示上调，16个下调，包括miR-17-92，miR-143/145，miR-21和miR-124等，在肺血管收缩和重构各个环节中发挥功能，不仅调控血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖、凋亡、促进血管新生，还参与血管平滑肌细胞增殖、凋亡及表型转化等过程[19]。如郭天聪等[20]研究发现，miR-182在IPAH患者中上调，并通过调节肌细胞增强因子2C促进平滑肌细胞增殖，参与IPAH发病机制。在IPAH患者中，内皮细胞无序增殖即为肺血管重塑形成，显示为丛状病灶，而肺组织学检查发现该病灶周围存在T细胞、B细胞、巨噬细胞及树突状细胞浸润，提示炎症细胞可能参与IPAH发生发展[21]。ICAM-1是一种细胞表面糖蛋白，参与并介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的相互黏附，是炎性反应形成的基础，在体外循环肺损伤的炎症反应过程中起重要作用[22]。如钟士杰等[23]研究显示，车前草提取物可通过降低缺氧性肺动脉高压SD大鼠模型泡灌洗液中ICAM-1等炎症因子水平，改善肺动脉及气道重塑。基于上述分析不难发现，miR-182与ICAM-1极有可能参与IPAH发生发展，当然这需要进一步验证。

随着PAH靶向药物的应用，发达国家IPAH患儿的生存率得到了明显改善，但不同国家对这些药物的使用并不完全相同，我国IPAH患儿的预后也尚未完全清楚。在本研究中，获得随访的72例IPAH患儿死亡率为29.17%（21/72），与朱燕等[24]报道的28.9%（11/38）基本一致。死亡组NYHA心功能分级（高级）占比，BNP，TB，RDW，sPAP，TPR，miR-182和ICAM-1水平均高于存活组，Logistic回归分析显示，NYHA心功能分级（高级）、RDW，sPAP，miR-182和ICAM-1是影响IPAH患儿预后的危险因素。上述研究结果再次提示miR-182和ICAM-1在IPAH的发生发展中占据重要地位，两种因子联合预测IPAH患儿预后的AUC为0.883，敏感度和特异度分别为87.10%，62.50%，优于各指标单独预测，提示miR-182，ICAM-1与IPAH患儿预后关系密切，可能是反映IPAH患儿预后的敏感指标，联合检查可在一定程度上提高预测效能，为临床预测IPAH患儿预后提供更准确的数据参考，对该类IPAH预防、控制与治疗具有重要意义。但本研究病例样本有限，可能存在一定的数据偏倚，后续需收集更多病例做更深入研究，以获取更为可靠的数据支持。

综上所述，IPAH患儿血清miR-182和ICAM-1表达水平较高，二者联合检测在预测其预后情况方面具有较高临床应用价值，可为IPAH患儿的诊断、预防及治疗提供参考。