新疆维吾尔族静脉血栓患者Th17/Treg细胞及相关细胞因子和细胞黏附分子整合素β表达水平及临床意义

邝 辉,尚 娟,努尔比叶,郑伟萍,杨 凡

（1.喀什地区第二人民医院检验科，新疆喀什 844000；2.上海市同济医院检验科，上海 200065）

静 脉 血 栓 栓 塞 症（venous thromboembolism,VTE）是一种临床漏诊率和死亡率都很高的疾病，其发病原因至今尚不十分清楚[1]。南疆地区维吾尔族人群由于种族特性、生活方式和饮食习惯等的特殊性，VTE发病率较汉族人群更高，发病年龄也更早，给当地人民带来严重的生命和健康威胁[2]。研究证实，VTE的发生与人体免疫功能缺陷密切相关，VTE患者普遍存在细胞免疫平衡功能的紊乱[3]。辅 助 性T细 胞 17（T helper 17 cells，Th17）通 过分泌多种细胞因子促进炎症反应，而调节性 T细胞（regulatory T cells，Treg）可以抑制T细胞免疫活性降低炎症导致的损伤[4]。Th17/Treg平衡对于维持人体免疫内环境稳定意义重大，Th17/Treg平衡失调是包括静脉血栓在内的多种疾病发生的重要影响因素[5]。另外研究表明，细胞黏附与血栓的形成有关，其黏附分子家族中选择素家族、整合素家族及免疫球蛋白超家族等可通过介导内皮细胞、血小板、白细胞等细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质的相互作用，参与血栓的溶解过程及深静脉血栓的形成[6-7]。因此本研究通过检测新疆维吾尔族VTE患者外周血中Th17/Treg细胞及其相关细胞因子和黏附分子的水平变化，来探讨Th17/Treg在维吾尔族VTE患者中的表达及其对VTE的临床诊断价值，以期为寻找新的诊断标志物和治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性选择2017年1月～2019年6月喀什地区第二人民医院确诊的维吾尔族VIE患者63例作为研究对象，VTE诊断标准：①具备术后、长期卧床、炎症、肿瘤、妊娠、高龄和肥胖等高危因素；②具有胸痛、呼吸困难、下肢肿胀等临床症状；③临床wells危险评分达到3分以上或2分以上并发D-二聚体阳性；④所有病例均经螺旋CT，多普勒超声或静脉造影明确诊断。VIE患者中男性35例，女性29例，年龄28～76（54.15±12.64）岁。同时以排除静脉血栓和VTE高危因素的维吾尔族体检健康人群70例作为对照组，其中男性38例，女性32例，年龄在29～75（52.63±11.25）岁。两组患者性别、年龄及实验室各项血细胞检测参数等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1，具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，所有患者均签署知情同意书。

表1 VTE组与对照组一般资料比较[±s，n(%)]

表1 VTE组与对照组一般资料比较[±s，n(%)]

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1.2 仪器和试剂 PerCP-Cy5.5标记的抗CD3，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗CD4，藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗CD194和CD127，别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的抗CD25和CD196单克隆抗体（北京同生时代生物技术有限公司）；流式细胞仪（FACS Via，美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 血液样本采集：入院后采集VTE组患者外周静脉血2 ml，对照组于体检当日采集外周静脉血2 ml，均肝素抗凝保存。

1.3.2 Th17细胞检测：取新鲜抗凝全血100 μl，每管加入PerCP-Cy5.5标记的抗CD3，FITC标记的抗CD4，PE标记的抗CD194和APC标记的抗CD196单克隆抗体各10 μl，充分混匀后室温避光孵育25 min；加溶血素1 ml，37 ℃孵育25 min，洗涤三次后上流式细胞仪检测。

1.3.3 Treg细胞检测：取新鲜抗凝全血100 μl，每管加入PerCP-Cy5.5标记的抗CD3，FITC标记的 抗CD4，APC标记 的 抗CD25和PE标 记的 抗CD127单克隆抗体各10 μl，充分混匀后室温避光孵育25 min；加溶血素1 ml，37 ℃孵育25 min，洗涤3次后上流式细胞仪检测。

1.3.4 细胞因子检测：采用RAISECARE多重微球流式免疫荧光发光法试剂盒检测，取新鲜抗凝全血2 ml，离心吸取25 μl血浆加入到已加有25μl实验缓冲液样本管中，标准曲线管则加25 μl基质和25 μl校准品；所有管中加入25 μl捕获微球抗体和25 μl检测抗体，室温避光震荡孵育2 h（400～500 r/min）；加入25 μl藻红蛋白标记的链霉亲和素（SA-PE），室温避光震荡孵育0.5 h（400～500 r/min），洗涤2次后加入150 μl缓冲液重悬微球上流式细胞仪检测。

1.3.5 整合素检测：取3管，每管加入肝素抗凝血100 μl，分别加入藻红蛋白（PE）标记的抗CD29和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD4（整合素β1，CD4+CD29+）、抗CD18（整合素β2）、抗CD61（整合素β3）单克隆抗体（Invitrogen），室温避光孵育30 min后加入溶血素500 μl，37 ℃孵育30 min后洗涤三次后上流式细胞仪检测。

1.4 统计学分析 采用SPSSl8.0软件对实验数据进行统计分析。所有计量资料采用均数±标准差(±s)的方式表述，组间表达差异比较采用独立样本t检验；计数资料采用例数（%）表示，组间差异比较采用χ2检验；临床诊断价值分析采用受试者工作曲线（ROC曲线）。所有统计分析均采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者Th17/Treg表达情况比较 见表2。与对照组相比，VTE组患者Th17细胞（CD3+CD4+CD194+CD196+）和Treg细 胞（CD3+CD4+CD25+CD127+，CD127为弱阳性）表达水平均明显增高，差异具有统计学意义（均P＜0.01），且Th17升高幅度大于Treg，导致Th17/Treg比例增大。

表2 VTE组和对照组Th17/Treg表达比较（±s）

表2 VTE组和对照组Th17/Treg表达比较（±s）

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2.2 两组患者Th17，Treg相关细胞因子表达比较见表3。与对照组相比，VTE组患者Th17细胞和Treg细胞分泌的相关细胞因子IL-6，IL-17，IL-2，IL-10和TNF-α均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），其中IL-6，IL-17升高最为明显。

表3 VTE组和对照组Th17，Treg相关细胞因子表达（±s, pg/ml）

表3 VTE组和对照组Th17，Treg相关细胞因子表达（±s, pg/ml）

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2.3 两组患者整合素β分子表达比较 见表4。VTE组患者整合素β1，β2和β3分子表达均值明显高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表4 VTE组和对照组整合素β1，β2，β3分子表达比较［（±s ）%］

表4 VTE组和对照组整合素β1，β2，β3分子表达比较［（±s ）%］

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2.4 ROC曲线预测Th17，Treg细胞及整合素β对VTE的诊断效能 见图1和表5。以临床诊断结果为标准，经绘制ROC曲线分析显示，Th17，Treg细胞及Th17/Treg比值最佳截断值分别取27.45%，11.26%，2.51时诊断灵敏度、特异度均较高，诊断VTE的AUC值分别为0.826，0.809和0.745，均＞0.7，诊断效能良好。当整合素β1，β2，β3最佳截断值分别取13.97%，93.75%和12.88%时诊断VTE的AUC值分别为0.723，0.706和0.698，诊断灵敏度、特异度均较高。

3 讨论

目前，静脉血栓发病机制仍不十分清楚，但多项研究表明其发生与细胞免疫平衡破坏关系密切。研究表明，VTE患者自然杀伤细胞和T淋巴细胞功能显著下调[8]。急性VTE患者组普遍存在CD3，CD8，NK和CD19表达显著降低或表达失衡[9]。指出静脉血栓细胞免疫功能失衡存在多种细胞因子的表达异常，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等多种炎性因子和细胞间黏附分子-1，整合素等多种黏附分子的表达异常增高是静脉血栓形成的重要特征[10]。故积极探究细胞免疫功能失衡在VTE形成中的意义及其临床价值具有重要意义。

Th17和Treg是重要的细胞免疫功能性调节分子，均由初始T细胞分化而来，但在功能上互相拮抗，其中Th17主要通过分泌IL-17，IL-21，IL-6和TNF-α等多种细胞因子促进炎症反应[4]，而Treg通过分泌IL-2，IL-10和TGF-β等细胞因子可抑制炎性细胞因子和抗体的产生，抑制Th17的作用[11]。在机体内Th17和Treg保持动态平衡，共同维持机体免疫内环境的稳定，其平衡被打破就会导致感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等多种疾病的发生[12]，也是近年临床实验研究的一大热点。在静脉血栓的研究中，既往王彬等[13]曾研究表明，急性期下肢深静脉血栓（DVT）患者体内Treg亚群比例降低，Th17亚群比例及IL-17水平明显升高，DVT急性期Th17亚群占主导地位。一项动物实验中孙涛等[14]表明，DVT模型大鼠发病过程中Th17亚群比例亦升高，Treg亚群比例亦降低，Th17/Treg＞1失衡，均提示Th17/Treg失衡参与DVT的发生。另据近年报道，白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-10等）参与DVT过程，DVT患者血浆IL-17A高表达，其通过促进中性粒细胞浸润、血小板聚集及内皮细胞激活促进了DVT形成[6]。且研究发现，大鼠血清IL-17表达升高与DVT形成呈正相关，IL-17A上调血小板聚集率，可通过调节巨噬细胞炎性蛋 白（macrophage inflammatory protein 2, MIP-2）表达和中性粒细胞外诱捕网的释放，促进中性粒细胞向血栓的浸润，加重DVT[15]。IL-6可通过调节巨噬细胞的募集，增强其在血栓中基质金属蛋白酶（MMPs）和尿激酶型纤溶酶原激活物（PLAU）表达，促进血栓溶解[16]。IL-10启动子多态性及IL-10-1082A/G基因多态性与VTE形成相关，IL-10可作为血栓形成的重要临床预测指标[17]。而本研究在对南疆地区维吾尔族静脉血栓患者的研究中发现，VTE患者Th17和Treg细胞表达明显升高，Th17升高程度较Treg大，反映在Th17/Treg比例明显增高，这说明静脉血栓发生时存在细胞免疫内环境的破坏，Th17/Treg平衡失调。相关细胞因子检测结果也证实Th17和Treg细胞分泌的细胞因子明显增加，特别是炎症因子IL-6和特征性细胞因子IL-17增加更为显著。IL-17是T细胞介导的炎症反映的早期启动因子，可以促进血管局部炎症发生[18]。而IL-6则有诱导分化Th17细胞，抑制Treg分化的作用，可以导致免疫失衡，产生细胞因子风暴，使炎症反应放大[19]。IL-6和IL-17的异常升高反映血栓形成时炎症反应被不断放大，形成恶性循环，导致免疫功能的进一步失衡，使病情加重[6,15]。

另一方面，由于炎症和细胞因子的作用，淋巴细胞分泌整合素，介导白细胞和血小板在血管局部聚集，破坏血管内皮细胞最终导致血栓形成整合素是一种细胞黏附分子亚单位，负责细胞内外信号传导及调控细胞间相互作用，是静脉血栓形成的关键环节[21]。整合素在动脉粥样硬化、血栓、血管新生或重构及动脉瘤等心血管疾病中发挥重要作用，是心血管疾病治疗的新靶点[21]。且发现整合素与血栓形成关系密切，并研究表明整合素αⅡaβ3与载脂蛋白A4结合能够抑制血栓的形成[22]。炎性小体NLRP3通过IL-1β能够调控αⅡaβ3进而影响血栓形成，提示血栓与炎症之间存在一种新的分子连接[23]。而本研究检测发现维吾尔族静脉血栓患者整合素β1，β2和β3分子均高表达，说明整合素分子在静脉血栓的形成中具有重要作用。绘制ROC曲线，显示Th17/Treg细胞及整合素β对VTE均具有良好的预测价值，诊断AUC值及灵敏度和特异度均较高，提示其对VTE具有一定的临床诊断价值，可将其作为南疆地区维吾尔族患者VTE发生与否的诊断标志物。然而本研究为单中心样本分析，样本有限，Th17/Treg细胞及整合素β对VTE的诊断界值尚需继续探究验证。

综上所述，Th17/Treg平衡失调及相关细胞因子和黏附分子的异常增高是VTE发生机制中的重要特征，可以通过监测Th17/Treg及其细胞因子和整合素的变化来预测评估是否发生血栓，为VTE早期诊断和疗效评定提供客观依据，并为将来开发新型药物来调整免疫内环境，重新恢复细胞免疫平衡来控制炎症、防治VTE提供新的思路。