云南地区肾移植受者BK病毒感染与HLA等位基因相关性分析

汪佳婕，潘永圣 ，安 婧，蒲 丹(昆明市第一人民医院检验科，昆明 650011)

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是代表人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）最复杂的多态基因簇[1-2]，是一种可以识别所有有核细胞上同种异体抗原的表达分子[3]，可将抗原呈递给淋巴细胞并启动特异性免疫应答，密切参与对病毒的免疫反应[4]，尤其对多瘤病毒BK引起的BK病毒（BKV）相关肾病 (BKVAN)，也被认为是肾移植患者移植物丢失的相关风险因素[5-6]。其中，HLAⅠ类分子呈递的病毒肽与CD8+T细胞相互作用，而HLAⅡ类分子与CD4+T细胞相互作用[7]，在控制感染和诱导抗病毒免疫中起着关键作用。研究表明，CD4+T细胞在人类 BKV 感染中有充分的记录，某些HLA等位基因可通过将抗原表位从保守的病毒蛋白优先呈递至免疫系统来提供保护或导致病毒感染的进展减慢

[8]，直接参与抗BKV的免疫应答。在肾移植中，受体免疫系统的主要目标是供体细胞表面的HLA分子，因此，评估肾移植受者Ⅰ类和Ⅱ类HLA抗原有助于BKV筛查和早期的干预。云南地区HLA-B,HLA-DR等位基因与 BKV的相关性研究至今尚未见有报道，本文就HLA-B, HLA-DR等位基因与BKV之间的相关性展开分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月～2020年12月昆明市第一人民医院肾移植科检查BK病毒DNA的肾移植患者399例为研究对象，其中男性276例，女性123例，年龄3～70岁；通过实时定量聚合酶链方法检测尿液BKV的DNA，其中感染组126例（尿液BKV DNA载量＞2.00×103copies/ml），尿液BKV阴性（BKV未感染组）273例（尿液BKV DNA载量＜2.00×103copies/ml或无Ct值）。两组参与者均对实验知情同意，并通过医学伦理委员会批准。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 实验主要仪器设备：基因扩增仪（BIOER，杭州博日仪器有限公司），多功能流式点阵仪（Luminex 200，美国Luminex公司），核酸浓度测定仪（Qbit4，赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2.2 实验主要试剂：血液基因组DNA提取试剂盒（DP348-02，北京天根生化科技有限公司），HLA-SSO LABType分型试剂盒（美国One lambda公司），Taq DNA聚合酶（上海普洛麦格生物产品有限公司）等。

1.3 方法 采集肾移植受者静脉血2～3ml至EDTA-K2抗凝真空采血管充分混匀，用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，Qbit4测定DNA浓度并调整至15～25 ng/µl。配制PCR反应体系（D-mix13.8µl/人份+Primer4µl/人份+DNA聚合酶0.2µl/人份+DNA2µl/人份，终体积为20µl），分别利用HLA-A，HLA-B，HLA-DR，HLA-DQ位点的不同引物进行扩增。PCR结束后，将产物变性、中和，分别加入四种寡核苷酸探针标记的微珠混匀，60℃杂交15min。杂交结束后，加入SAPE染料进行染色，然后将杂交板转移至 Luminex 200平台进行数据获取，使用Fusion软件进行结果分析（具体操作步骤参照试剂说明书）。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0（IBM公司）统计软件进行数据分析，采用Hardy-Weinberg 进行吻合度检验。计数资料用例数和百分率表示，两组间等位基因频率比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。进行HLA-B，HLA-DR抗原与BKV感染的相关性分析，计算OR值及95%CI。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BKV感染组和对照组的 HLA-B 等位基因分布频率 见表1。BKV感染组和BKV未感染组的HLA-B等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。BKV未感染组检出的HLA-B等位基因有33种，其中占比大于10%的基因型有7种，分别为HLA-B*13（16.85%），HLA-B*46（19.41%），HLA-B*51（10.62%），HLA-B*55（10.62%），HLA-B*60（17.58%），HLA-B*62（24.91%）和HLA-B*75（16.48%）；BKV感染组中检出的HLA-B等位基因有25种，其中占比大于10%的基因型有5种，分别为HLA-B*46（24.60%），HLA-B*55（10.32%），HLA-B*60（24.60%），HLA-B*62（22.22%）和HLA-B*75（15.87%）。BKV未感染组中HLA-B*13（16.85%）的频率高于BKV感染组（8.73%），差异有统计学意义（χ2=4.642，P=0.031）。

表1 BKV感染组与BKV未感染组HLA-B等位基因的数量及分布频率

2.2 BKV感染组和BKV未感染组的 HLA-DR 等位基因分布频率 见表2。BKV感染组和BKV未感染组的 HLA-DR 等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。BKV未感染组检出的 HLADR等位基因有14种，其中占比大于10%的基因型有7种，分别为 HLA-DR*4（30.40%），HLADR*8（15.75%）， HLA-DR*9（20.15%）， HLADR*11（12.45%），HLA-DR*12（42.12%）, HLADR*14（20.15%）， HLA-DR*15（25.27%）；BKV感染组中检出的 HLA-DR等位基因有14种，其中占比大于10%的基因型有8种，分别为 HLADR*4（27.78%）， HLA-DR*8（18.25%）， HLADR*9（16.67%）， HLA-DR*11（11.11%），HLA-DR*12（42.86%），HLA-DR*13（11.90%），HLA-DR*14（23.81%），HLA-DR*15（19.84%）。BKV感染组中HLA-DR*17（9.52%）的频率高于BKV未感染组（4.03%），差异有统计学意义（χ2=4.791，P=0.029）。

表2 BKV感染组与BKV未感染组HLA-DR等位基因的数量及分布频率

2.3 HLA-B，HLA-DR抗原与BKV感染的相关性分析 进一步比较差异有统计学意义的HLA-B等位基因和BKV感染的相关性。HLA-B*13是抗BKV的保护因子（χ2=4.285,P=0.031，OR=0.472，95%CI：0.236～0.946），HLA-DR*17是 抗BKV的危险因素（χ2=4.791,P=0.029, OR=2.507, 95%CI:1.075～5.849）。

3 讨论

随着人类白细胞抗原（HLA）失配的减少，我们注意到BKV阳性的增加。BORNI-DUVAL等[3-4]在报道中提到BKV的患病率可高达20%。研究表明，特定的HLA等位基因可能与BKV感染的风险有关。HLA等位基因参与BK抗原呈递并引发细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞免疫介导的反应。HLA I类分子在细胞毒性CD8+T细胞的帮助下对病毒有效，I类HLA分子可以有效抵抗病毒[8-10]。MASUTANI等人[6]发现HLA-A2，HLA-B44，HLA-C6，HLADR7，HLA -DR15和HLA -DR51匹 配 与 较 低 的BKV风险相关，而KAVUZLU等[7]人最近的一项回顾性研究，表明了肾移植受者中 HLA-A，HLA-B和HLA -DR与BKV的相互关系，发现 HLA-B*13等位基因具有保护性，使BKV感染几率降低了86%。

很少有研究调查肾移植患者中HLA等位基因与BKV之间的关系，而HLA的错配（不匹配）已经成为BKVAN的危险因素之一[11]，目前尚未有研究证实总体HLA失配与BKV肾病的发生之间有任何关联[12]，但研究表明HLA对BKV感染的演变是双向的。某些特定的 HLA等位基因可能是BKVAN的诱因[5]，而另一些则可能是保护性的[6]。由于HLA等位基因较多，此次研究选择与BK感染方向一致的等位基因进行相关性分析。通过近年的研究发现国内关于不同民族间 HLA多态性与BKV相关性研究结果在不同地区、不同民族及人群中差异较大。因此，本研究选取云南地区BKV感染组和BKV未感染组，对HLA等位基因HLA-B，HLA -DR进行检测，并进行统计学分析。结果表明HLAⅠ类分子中的HLA-B*13等位基因是保护性因子（χ2=4.285，P=0.031，OR=0.472，95%CI：0.236～0.946），此结果与KAVUZLU等[7]的研究结果一致。同时云南地区人群感染BKV的机会可能与HLA-DR*17呈正相关，HLA-DR*17可 能 是BKV的 易 感 基 因（χ2=4.791,P=0.029，OR=2.507，95%CI：1.075～5.849），本研究结果说明，HLA-DR*17等位基因可能会增加BKV感染的风险。

影响BKV感染过程的人类白细胞抗原 (HLA)不仅能预测病毒尿自发消退或进展为病毒血症和相关肾病的可能性，还有助于制定 BKV早期筛查和干预措施，对最有可能患上疾病的患者进行更频繁的病毒检测。最小化的降低免疫抑制剂的使用，并且在总体上改善患者和同种异体移植的结果，同时，研究HLA等位基因与BKV的相关性也为供-受者的选择提供新的可能。为了更好地阐述BK感染与HLA基因型在不同人群中的关系,我们应该加强全世界范围内的协作，扩大 HLA上不同基因座位研究，增强对不同人群BKV感染与HLA相关性研究的探索，为BKV的防治寻找新的突破口，从而使人类从基因水平预防BKV感染，为治疗BKV所致疾病提供可能。