光谱CT量化的细胞外容积评估结直肠癌神经、血管及淋巴管浸润

郑文霞，王莉莉，陈杏彪，郑小霞，崔雅琼，马颖，魏照坤，梁小芹，黄刚*

1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院放射科，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省人民医院病理科，甘肃 兰州 730000；4.飞利浦医疗临床科研部，上海 200070；*通信作者 黄刚 keen0999@163.com

近年来，随着生活习惯及饮食结构的变化，结直肠癌的发病率居高不下，且发病年龄逐渐年轻化[1]。结直肠癌的早期精准诊断有助于使患者得到早期临床干预，能够最大程度地降低疾病带来的生理损伤。双层探测器光谱CT是新型的基于探测器的能谱CT，一次扫描即可获得高低能量数据，能够比常规CT提供更多的参数和图像信息[2]，同时还可以发现和诊断肿瘤早期隐匿病灶[3]，为结直肠癌的影像诊断提供了新的思路和方法。相关研究表明基于光谱CT 40 keV的单能级图像可以提高直肠癌术前T分期的准确度[4]，有利于个体化治疗的决策评估。

细胞外基质是肿瘤微环境的重要组成部分[5]，细胞外容积（extracellular volume，ECV）是细胞外基质的量化因子。目前ECV的临床应用多集中于心脏方面，如评估心肌纤维化[6]、预测心肌梗死[7]、心肌淀粉样变的诊断及预后[8]等，也可用于评估肝纤维化分级[9]。随着研究者对肿瘤微环境关注度上升，ECV在肿瘤中的应用也在逐渐增加。Song等[10]在III期结直肠癌患者预后的研究中，发现血管、淋巴管内癌栓的形成与免疫异质性肿瘤微环境密切相关。而目前临床上通常需要通过病理组织活检获取神经、血管、淋巴管浸润状态。本研究通过使用基于双层探测器光谱CT增强扫描测定的ECV值评估结直肠癌组织是否存在神经、血管及淋巴管浸润带来的肿瘤细胞微环境改变，以期获得一种术前评估的方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2020年7月—2021年2月在甘肃省人民医院就诊的95例结直肠癌患者，年龄32～84岁，平均（60.5±10.7）岁；结肠癌22例，直肠癌73例。纳入标准：①首次诊断结直肠癌，无化疗及手术病史；②术前行光谱CT检查，术后病理诊断为结直肠癌。排除标准：①病理资料不全，或为腺瘤及其他良性肿瘤；②图像有伪影不满足测量要求。本研究经本院医学伦理委员会批准（2021-196），所有患者检查前均签署知情同意书。患者一般资料见表1。

表1 95例结直肠癌患者一般资料

1.2 CT检查方法 所有患者用光谱CT进行增强扫描，采用双筒高压注射器，从肘正中静脉注入1.5 ml/kg碘克沙醇（320 mgI/ml），速度3.5 ml/s，随后以相同速度注入50 ml生理盐水。采集25 s动脉期、60～70 s静脉期及2 min延迟期图像。主要参数：层厚5 mm，管电压120 kV，自动毫安秒，螺距0.953，转速0.5 s/转。采集后图像利用IntelliSpace Portal 10.1后处理工作站进行数据测量。

1.3 图像分析及数据测量 患者行光谱CT增强后选择静脉期及延迟期图像，重建后的光谱基数据导入后处理工作站，测量结直肠肿瘤病变两期的碘密度（iodine density，ID）：感兴趣区选择在肿瘤实质区域，范围35～55 mm2，避开非肿瘤部位、水肿区及血管伪影，测量3个不同层面感兴趣区ID的平均值，并同时测量肿瘤同层面腹主动脉或髂外动脉ID的平均值。用同一方法对纳入患者选择其病变上或下5个层面的正常肠壁及血管，测量两期的ID。计算ECV，ECV（%）=（1-红细胞压积）×（IDROI/IDblood）×100，其中红细胞压积于检查前3 d内采集，IDROI为肿瘤及正常肠壁的ID，IDblood为肿瘤同层面腹主动脉或髂外动脉的ID。为保证结果的可重复性，3个月后重新测量一次数据。

1.4 病理及免疫组化检查 所有送检组织送病理切片，病理阳性标准严格按照试剂说明书进行。疑有血管、淋巴管内癌栓及神经侵犯者行免疫组化染色，血管、淋巴管及神经侵犯分别用CD31、D2-40、S100表示，染色后棕黄色为（+），见图1。

图1 血管、淋巴管内癌栓及神经侵犯病理免疫组化染色（20×10）。A.血管内癌栓（箭）；B.淋巴管内癌栓（箭）；C.神经侵犯（+，箭）

1.5 统计学分析 采用SPSS 25.0软件，符合正态分布的计量资料用±s表示，两组比较采用独立样本t检验，计数资料以例数或百分比表示，前后2次测量结果用组内相关系数（ICC）检验。以术后病理结果为“金标准”，应用受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析ECV的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管、淋巴管、神经侵犯阳性及阴性组间ECV比较 3项免疫组化阳性与阴性组的ECV在延迟期差异均有统计学意义（均P＜0.001），在静脉期差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2、图2～3。

图2 男，50岁，直肠下段中分化腺癌，无血管、淋巴管及神经侵犯，红细胞压积0.533。A.静脉期病变常规CT图；B.延迟期病变常规CT图；C.静脉期病变碘密度图，ECV=0.23；D.延迟期病变碘密度图，ECV=0.26

表2 静脉期及延迟期血管、淋巴管、神经侵犯阳性、阴性组的ECV比较

2.2 ECV对血管、淋巴管、神经浸润的诊断效能静脉期、延迟期ECV对于免疫组化的AUC分别为：血管侵犯0.576、0.798，淋巴管侵犯0.575、0.838；神经侵犯0.584、0.759，见表3、图4A～C。

表3 ECV对血管、淋巴管、神经侵犯的诊断效能

2.3 结直肠癌与同期正常肠壁的ECV比较 静脉期、延迟期ECV对于结直肠癌的AUC分别为0.962、0.975，两期结直肠癌与同期正常肠壁的ECV相比差异均有统计学意义（P均＜0.001），见表4、图3 E、F、图4D。

图4 ECV对结直肠癌神经、血管、淋巴管浸润及结直肠癌的受试者工作特征曲线。ECV-D为延迟期；ECV-V为静脉期；A.血管侵犯；B.淋巴管侵犯；C.神经侵犯；D.结直肠癌

表4 静脉期、延迟期结直肠癌与同期正常肠壁ECV比较

图3 男，60岁，直肠下段中分化腺癌，有血管、淋巴管及神经侵犯，红细胞压积0.421。A.静脉期病变常规CT图；B.延迟期病变常规CT图；C.静脉期病变碘密度图，ECV=0.23；D.延迟期病变碘密度图，ECV=0.40；E.静脉期正常肠壁碘密度图，ECV=0.09；F.延迟期正常肠壁碘密度图，ECV=0.15

2.4 一致性检验 结直肠癌与正常肠壁静脉期、延迟期测量结果的一致性良好（ICC均＞0.75）。

3 讨论

细胞外基质是位于机体细胞外的生物大分子，包括胶原蛋白、蛋白多糖以及各种代谢相关的酶和细胞因子等。细胞外基质在正常情况下抑制肿瘤生长，但在恶性肿瘤中发生变化，引起肿瘤微环境改变，在一定程度上可以反映肿瘤的演变情况[11]。肿瘤微环境是肿瘤发生、发展过程中由细胞外基质和基质细胞组成的复杂系统，基质细胞主要包括成纤维细胞、炎症免疫细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞等，其中癌相关成纤维细胞在肿瘤生长、进展和转移过程中起到关键作用。Kalluri[12]提出细胞外基质重塑性癌相关成纤维细胞（F4型），具有重塑细胞外基质的功能，增强了肿瘤的增殖和侵袭性。

ECV是细胞微环境中细胞外基质占据的空间，代表细胞外基质的体积分数，影像学检查测得的ECV值与组织活检测得的细胞外间质量具有一致性[13-15]，因此可以用ECV值定量表示病变的细胞外间质[16]。相关研究发现胰腺癌、胸腺瘤组织的ECV与肿瘤的治疗及预后相关[17-18]，本研究探讨通过ECV评估结直肠癌神经、血管及淋巴管浸润的可行性及诊断效能。

3.1 ECV评估结直肠癌神经、血管、淋巴管侵犯的价值神经侵犯是指结直肠癌的癌细胞侵犯神经鞘，诱发神经重塑和神经环境的改变，从而影响肿瘤的微环境，预示病变侵袭性强，容易引起扩散及转移[19]。血管、淋巴管癌栓的形成在临床上认为是肿瘤预后的重要危险因素。相关研究表明在子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤中，脉管癌栓形成是预后的独立危险因素[20-22]。

本研究利用增强后造影剂在组织细胞的分布，基于ID测量结直肠癌的ECV[23-24]，发现免疫组化表达阳性组的ECV升高明显，提示肿瘤破坏血管、淋巴管、侵犯神经等，可引起细胞微环境变化。血管、淋巴管、神经侵犯是肿瘤发生转移的关键因素，邵瑞丽[25]发现ECV可以预测结肠癌的肝转移及淋巴结转移，但其未纳入对血管、淋巴管、神经侵犯的研究。本研究发现静脉期所测ECV与免疫组化是否阳性之间差异无统计学意义，而延迟扫描的ECV值升高，且与免疫组化是否阳性差异有统计学意义，表明对比剂在细胞外间质中平衡分布可能需要较长的时间，在静脉期肿瘤组织内的对比剂还未达到细胞外间质的平衡状态[26]，此期ECV不能评估对肿瘤的神经、血管及淋巴管浸润，而延迟期可评估其状态[27]。本研究对比延迟期与静脉期的ECV，发现延迟期均高于静脉期，且对神经、血管和淋巴管是否浸润有明显差异，表明延迟期造影剂在织细胞间隙中的分布更接近平衡状态，更能反映肿瘤细胞外间质的变化。本研究同时测量正常肠壁的ECV作为对照，发现肿瘤组织的ECV高于正常肠壁，进一步表明ECV能够反映肿瘤的细胞外间质变化。

本研究中免疫组化表达阳性的ECV升高，与既往在结肠癌发生肝转移和淋巴结转移ECV值更高[25]的研究结果一致，即ECV升高是不良预后指标；而另一项研究发现在IV期胰腺癌中，肿瘤ECV分数较高的患者预后更好[18]，其原因可能是：虽然胰腺癌和结直肠癌均为消化道肿瘤，生物学特性却存在差异，胰腺癌为乏血供肿瘤，而结直肠癌血供较丰富，容易产生大量的肿瘤新生血管，对比剂进入细胞外间隙相对增多；同时胰腺癌更易发生坏死，也会影响ECV的结果，具体还需在今后的研究中进行大样本量及多中心验证。

3.2 ECV反映肿瘤细胞外间质改变可能的机制 肿瘤细胞的发生伴随着细胞外微环境的变化，在转化细胞与微环境中基质和免疫细胞的相互作用演化过程中，出现细胞外基质沉积、成纤维细胞激活、不断聚集，以及一些炎症细胞浸润，使得肿瘤细胞微环境的可视化量化因子ECV发生变化[28]。本研究结果显示肿瘤组织的ECV升高，进一步反映出结直肠癌微环境变化的病理改变，可能的机制为：一方面，肿瘤细胞数量越多，密度越大，合成的大分子蛋白增多，影响细胞整体运动，使造影剂扩散受限，在细胞外间隙滞留时间长[29]。另一方面，肿瘤相关的基质细胞通过刺激肿瘤血管生成、重塑细胞外基质，癌细胞与肿瘤微环境之间复杂的相互作用引起ECV的变化[30]。此外，恶性肿瘤新生血管网丰富、但欠成熟，血管脆性大，因此血流量、血容量、血管通透性明显增加，导致造影剂进入组织间隙增多引起ECV变化[31]。

3.3 本研究的创新点 ①结直肠癌的神经、血管、淋巴管浸润诊断依赖于有创的病理组织活检，本研究与既往研究相比，应用双层探测器光谱CT参数ID计算ECV，无创评估结直肠癌导致的肿瘤组织细胞外微环境改变，仅需采集一次红细胞压积及CT检查，避免了有创检查。②ECV在组织纤维化和淀粉样变研究较多，对肿瘤微环境改变的研究尚少，本研究为临床术前无创评估结直肠癌神经、血管及淋巴管浸润提供新的思路和方法，也为双层探测器光谱CT参数更好地应用于肿瘤研究提供了思路和参考。③目前关于ECV的研究多集中于普通CT，需要平扫和增强两项检查，本研究采用光谱CT碘密度参数，避免了二次扫描，且经增强图像测得的ECV易整合至常规检查中，于临床更为方便可行。

3.4 本研究的局限性 ①本研究样本量较小，仅纳入结直肠癌患者，腺瘤等良性肿瘤未纳入本研究，使结果有一定局限性。②结直肠属空腔器官，不同于实质器官，测量数据过程中虽尽量将感兴趣区放置在肿瘤实性部分提高准确度，但难以避免部分肿瘤组织坏死及水肿的影响，部分测量结果可能存在偏差。③关于延迟时间的确定，目前未见统一报道。本研究用2 min延迟扫描，用静脉期作为对照，结果显示两期ECV均可反映细胞微环境变化，但延迟期ECV值升高明显，能够反映肿瘤组织的神经、血管、淋巴管浸润情况，具体延迟时间更长是否更有意义有待进一步探索。④本研究纳入对象的红细胞压积均在检查前3 d内采集，不同时间窗可能影响结果的准确度，需在此后的研究中证实。⑤本研究探讨了ECV对结直肠癌发生神经、血管及淋巴管浸润的价值，但未进一步随访患者的生存期，今后将结合两方面的研究，对结直肠癌患者的转移因素及预后进行全面分析，得出更可靠的结果。

总之，经初步研究发现，ECV可以反映结直肠癌神经、血管、淋巴管浸润情况，也可以区分癌组织与正常肠壁。希望随着研究的不断跟进，ECV在结直肠疾病的诊断、淋巴转移及预后方面提供更多价值。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突