PLL-USPION-PMSCs分子探针靶向探测结直肠癌的MRI在体示踪研究

何花，王芳，王一帆，郭玉林*

1.宁夏医科大学总医院放射科，宁夏 银川 750004；2.中国人民解放军西部战区总医院，四川 成都 610000； *通信作者 郭玉林 guoyulin66@163.com

结直肠癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，早期有效的诊断和及时的根治性治疗是延长患者生存期的唯一方法。目前对于结直肠癌的发病机制已深入至分子水平。间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞，可以靶向迁移到受损组织、炎症区域及肿瘤部位[1-2]，目前在骨关节炎、股骨头坏死、烧伤组织的修复、肿瘤血管生成等方面的研究均取得了突破性的进展[3-6]，但在大多数研究中，间充质干细胞来源于骨髓。本研究采用人胎盘间充质干细胞（placental mesenchymal stem cells，PMSCs）对结直肠癌的作用进行研究，胎盘组织作为胎儿附属物，来源丰富，无伦理限制，可以在临床研究中得到广泛应用。MRI组织分辨率高，在进行多参数、多序列成像的同时可获得清晰的解剖结构及生理动态变化信息，是临床诊断结直肠癌的重要途径[7-9]。本研究利用多聚赖氨酸-超微、超顺磁氧化纳米铁颗粒蛋白复合物-人胎盘间充质干细胞（polylysine-ultramicro and superparamagnetic oxide nano-iron particle protein complexes and human PMSCs，PLL-USPION-PMSCs）分子探针靶向结直肠癌小鼠模型，活体动态观察其行分子成像的可行性，通过监测移植瘤内信号和成像参数的变化，以病理及免疫组化结果为标准，进行PMSCs与结直肠癌的相关研究。

1 材料与方法

1.1 PLL-USPION-PMSCs分子探针的构建 培养第3代人PMSCs（宁夏医科大学总医院干细胞研究所赠予），调整细胞浓度为3×106个/ml，PBS中检测细胞表面标志物的阳性表达率。将USPION与PLL按1∶0.03的体积形成PLL-USPION复合物后对PMSCs进行磁化标记，检测标记后的细胞生物学特性：标记率测定（铁标记率=蓝染细胞数/镜下细胞总数×100%）、以台盼蓝拒染率计算细胞活力、CCK-8试剂盒判断细胞增殖能力、采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡率。

1.2 BALB/c裸鼠移植瘤模型建立及分组 选取20只4～6周龄健康雌性BALB/c裸鼠[购于北京维通利华公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006]，饲养于宁夏医科大学动物中心SPF级实验室，体重18～22 g。PBS重悬HT-29细胞（人结直肠癌细胞，购于上海汉恒生物，细胞浓度约1×107个/ml），以100 μl/只接种于裸鼠右侧腹股沟皮下，约14 d后待肿瘤直径约5 mm时开始实验。将小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只，将重悬磁化标记后的PMSCs（细胞浓度5×106个/ml），以200 μl/只注入实验组荷瘤小鼠瘤内，以同样方法在对照组荷瘤小鼠瘤内注入200 μl不含细胞的PBS，观察两组裸鼠精神状态与移植瘤生长状况。本研究经过宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准（批准号：2015-015）。

1.3 移植瘤模型活体MR分子成像及图像分析 小鼠麻醉后按标准姿势置于动物线圈，使裸鼠移植瘤中心、线圈中心及磁场中心保持一致，扫描前通过VIP3000麻醉机以6.0 ml/h异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，进入深度麻醉状态时以2.25 ml/h进行持续麻醉，采用Philips公司3.0T MR仪、小动物线圈进行扫描。扫描序列：T2WI、T2mapping、T2*mapping，轴位扫描，层厚2 mm，层间距0.2 mm。T2WI：TR 2 000 ms，TE 140 ms，回波链长15，翻转角150°，视野 35 mm×35 mm，采集矩阵176×176；T2 mapping：TR 2 000ms，TE n*13 ms，分别为13、26、39、52、65、78 ms 6个回波，翻转角90°，视野50 mm×50 mm，采集矩阵124×124；T2*mapping：TR 28 ms，TE n*3 ms，分别为3、8、12、16、20、24 ms 6个回波，翻转角20°，视野30 mm×30 mm，矩阵100×96。分别于注射PMSCs前、注射PMSCs后1、3、7、10、14 d进行3.0T MRI，观察移植瘤内PMSCs的信号分布、变化特征，测量实验组与对照组肿瘤的大小：长径（a）、短径（b），计算肿瘤体积：V=1/2ab2，绘制生长曲线。

1.4 病理组织标本获取及免疫组化染色 注射PMSCs后2 d随机处死实验组和对照组小鼠各2只用于普鲁士蓝染色，其余小鼠均在注射后14 d行MR扫描后断颈处死，完整切除小鼠结直肠癌瘤体后称重，计算抑制率，抑制率=（A-B）/A×100%（A为对照组平均瘤重，B为实验组平均瘤重），抑制率为正值表示抑制肿瘤生长，负值表示促进肿瘤生长。免疫组化染色按说明书进行操作。CD31工作液浓度为1∶100，CD34为即用型抗体，分别计数血管内皮（CD31、CD34）标记指数，参照Weidner校正方法计算微血管密度。

1.5 统计学方法 使用SPSS 23.0软件，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组间不同时间点移植瘤体积比较采用重复测量的方差分析；同一时间点两组间移植瘤MRI定量参数、两组血管数量比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 注射PMSCs后移植瘤MRI信号变化 移植瘤在实验组和对照组T2WI、T2mapping、T2*mapping序列均呈高信号。实验组：注射PMSCs后1 d T2WI、T2 mapping、T2*mapping序列移植瘤边缘均可见条形低信号区；3 d肿瘤区低信号较1 d逐渐增多，并有向病灶中心趋化的现象，肿瘤组织信号减低，T2值、T2*值较1 d减低；7 d肿瘤区低信号较3 d继续增多，并有向病灶中心趋化的现象（图1A～C），肿瘤组织信号变化不明显，T2、T2*值最低；10 d部分小鼠肿瘤内低信号区已显示不清，肿瘤信号变化不明显，T2、T2*值升高；14 d所有小鼠肿瘤内低信号区基本消失，并出现液化、坏死区，T2、T2*值变化不明显。对照组：1～10 d肿瘤组织内T2、T2*值逐渐升高，3 d肿瘤组织T2、T2*值的变化率最明显，7～10 d变化率减低，14 d肿瘤组织T2、T2*值减低，对照组1～10 d肿瘤呈高信号，T2、T2*值逐渐升高，14 d肿瘤中心出现液化、坏死区，T2、T2*值略减低，两组T2、T2*值差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 结直肠癌移植瘤裸鼠模型不同序列、不同时间点的MRI图像。由上往下分别为T2WI、T2 mapping和T2*mapping序列，A～C分别为实验组注射PMSCs后第1、7、14 d扫描图像，D～F为对照组第1、7、14 d扫描图像；箭示移植瘤内磁化标记的PMSCs信号

表1 注射PMSCs后两组不同序列不同时间点MRI定量参数比较（±s）

表1 注射PMSCs后两组不同序列不同时间点MRI定量参数比较（±s）

分组序列1 d 3 d 7 d 10 d 14 d F值P值实验组（n=10） T2 62.085±2.007 54.785±1.529 72.785±1.529 82.785±1.529 76.785±1.529 24.472 0.000对照组（n=10） 60.085±2.813 72.239±1.259 85.907±4.764 89.910±1.042 90.573±3.999实验组（n=10）80.578±6.347 72.797±3.021 88.797±5.021 94.533±4.021 84.797±2.021对照组（n=10）T2*84.352±3.162 92.441±2.196 106.547±3.203 110.329±1.103 111.711±4.445 8.963 0.010

2.2 肿瘤体积及重量比较 实验组小鼠注射PMSCs前到注射PMSCs后第14 d生长趋势与对照组相似，1～7 d实验组平均体积大于对照组（表2），3～7 d实验组与对照组体积差距减小，生长速度减慢，1～14 d实验组肿瘤体积小于对照组（表3），两组体积差异有统计学意义（P＜0.05），抑瘤率为10.2%。

表2 注射PMSCs后第1～7 d同一时间点两组肿瘤体积变化比较（mm3，±s）

表2 注射PMSCs后第1～7 d同一时间点两组肿瘤体积变化比较（mm3，±s）

扫描时间实验组（n=10）对照组（n=10）t值P值1 d 5.58±1.08 5.24±1.12 3.287 0.004 0.000 7 d 6.77±1.04 6.70±1.03 0.695 0.506 3 d 6.34±1.04 5.61±1.03 7.513

表3 注射PMSCs后不同时间点两组肿瘤体积变化比较（mm3，±s）

表3 注射PMSCs后不同时间点两组肿瘤体积变化比较（mm3，±s）

分组1 d 3 d 7 d 10 d 14 d F值P值实验组（n=10） 5.58±1.08 6.34±1.04 6.77±1.04 6.93±1.06 7.98±1.05 4.320 0.030对照组（n=10）5.24±1.12 5.61±1.03 6.70±1.03 7.85±1.04 9.15±1.05

2.3 相关病理指标结果 注射PMSCs次日取材行普鲁士蓝染色，实验组红色肿瘤组织边缘区域可见蓝染颗粒；HE染色后均发现移植瘤新生血管丰富，呈棕褐色条索状，且微血管密度分布不均匀，肿瘤间质内微血管密度的形态及大小差异较大，血管间可见灶性坏死、凋亡，凋亡区部分血管轮廓破坏。免疫组化显示两组移植瘤内均见大量CD31、CD34阳性细胞分布（图2），按照Weidner的判断标准计数，实验组CD31、CD34分别为35.0±5.7、38.0±4.5，对照组分别为32.0±4.3、

图2 对照组与实验组普鲁士蓝（A、E，×200）、HE（B、F，×40）、CD31（C、G，×40）、CD34（D、H，×40）染色结果。A～D为实验组；E～H为对照组

35.0±2.6，两组血管数量差异均无统计学意义（t=0.245、0.270，P＞0.05）。

3 讨论

3.1 PLL-USPION-PMSCs分子探针在结直肠癌移植瘤中的MRI分析 MRI具有组织分辨率高、可以多参数、多序列成像的优点，同时可以获得清晰的解剖结构及生理动态变化信息，作为研究组织生化状态的一项新技术，可为活体状态下研究疾病分子机制提供有力支持[10-11]。由于USPION标记细胞后对T1弛豫影响较小，因此在目前以氧化铁为基础的分子探针MRI中，国内外学者普遍选择T2WI、T2 mapping、T2*mapping序列，并且T2*值可以更加敏感地反映组织内磁敏感性的改变。T2 mapping与T2*mapping技术通过回波-信号曲线拟合形成伪彩图实现组织中铁颗粒的量化，可以间接反映组织内含铁浓度[12-13]。同时，本课题组前期研究[14]显示，在MRI对USPION磁化标记PMSCs的示踪中，T2*mapping序列总体图像质量较高，且图像的信噪比、标记细胞与肿瘤的组织对比度、图像对比度最高，在铁标记细胞的示踪研究中比T2WI、T2mapping序列更优越。

本研究显示实验组1 d T2WI、T2mapping、T2*mapping序列移植瘤边缘均可见条形低信号区，即为磁化标记的PMSCs；注射3 d肿瘤区低信号较1 d逐渐增多，并有向病灶中心趋化的现象。大量研究证实MRI图像中局部降低的信号区95%以上来自标记细胞[15]，当标记细胞被巨噬细胞吞噬后，其内的铁颗粒会迅速代谢，不会影响标记细胞呈低信号的特异性显示。因此本研究中实验组MRI图像移植瘤内低信号区即为USPION标记后的PMSCs。目前部分研究[2,16]显示间充质干细胞特异性地归巢至组织损伤部位的

机制与白细胞向炎性组织归巢的过程类似，即肿瘤在

生长过程中会分泌趋化因子、黏附分子、生长因子和

酶等物质，这些物质作为配体与间充质干细胞上的相应受体特异性结合后具有驱动间充质干细胞归巢的作用。本研究中实验组注射PMSCs后1～3 d肿瘤组织信号减低，且T2、T2*值减低，表明在结直肠癌移植瘤中PMSCs有向肿瘤组织归巢的趋势，因此肿瘤组织信号会随时间增加逐渐降低。注射7 d肿瘤组织信号变化不明显，T2、T2*值最低；注射10 d部分小鼠肿瘤内低信号区已显示不清，肿瘤信号变化不明显，T2、T2*值升高；注射14 d所有小鼠肿瘤内低信号区基本消失，并出现液化、坏死区，肿瘤组织内T2、T2*值变化不明显表明PMSCs在7 d开始逐渐代谢，14 d基本代谢完全。

3.2 肿瘤体积及重量分析 实验组小鼠MRI动态观察期间移植瘤生长趋势与对照组相似，观察前期实验组平均体积大于对照组，之后两组移植瘤体积差距减小，生长速度减慢，最终实验组肿瘤体积小于对照组，两组体积有显著差异，抑瘤率为正值，表明PMSCs在注入结直肠癌移植瘤前期起到了促进作用，随着时间的推移其对肿瘤的抑制作用逐渐展现。抑瘤率为正值提示PMSCs对结直肠癌移植瘤最终作用为抑制。这也表明PMSCs对结直肠癌的促进或抑制作用是动态变化的。

3.3 相关病理指标分析 近年来，相关研究表明肿瘤生长必需营养物质的供给依赖于肿瘤血管生成，微血管密度可作为判定肿瘤预后的一项独立指标，已在乳腺癌、大肠癌、胃癌等恶性肿瘤中得到证实[17-19]。CD31为血小板-内皮细胞黏附分子，位于血管内皮细胞、巨噬细胞、血小板等表面，促使肿瘤细胞对内皮细胞的黏附，它通常表达在幼稚血管，在细胞质或细胞膜表达阳性，随着肿瘤内新生毛细血管的增加，CD31表达增高。CD34为高度糖基化的跨膜糖蛋白，作为创伤愈合、免疫应答、炎症反应及肿瘤转移等一系列病理生理过程的分子基础，是重复性好、稳定性高、较成熟的血管内皮标志物，作为常规指标应用于多种恶性肿瘤的免疫组化检测，因此本实验选取CD31、CD34标记结直肠癌组织。本实验按照Weidner的判断标准计数两组移植瘤微血管密度，血管数量未见明显差异，无法明确体现PMSCs对结直肠移植瘤血管生成的作用。分析其原因可能为：HT-29恶性程度较高，增殖能力较强，代谢较快，可能在PMSCs发挥

有效作用前，肿瘤即已广泛侵袭、坏死；或是PMSCs

在较短时间内已经被肿瘤代谢并排出体外。部分研究

显示肿瘤的高度血管化发生于早期，进而达到高峰，然后维持新的血管形成，说明肿瘤血管生成与肿瘤分级及临床分期密切相关，本实验中未进行明确的分级及分期也可能是造成阴性结果的一种因素。

总之，3.0T MRI可安全、有效地实现PLL-USPIONPMSCs对结直肠癌移植瘤的分子靶向成像，PMSCs对结直肠癌有定向趋化作用，可以聚集至肿瘤内，MRI中T2mapping和T2*mapping序列可以较好地观察、分析磁性标记后的PMSCs的迁徙、转归以及对移植瘤的影响，结合肿瘤组织病理切片及免疫组化结果初步得出PMSCs对结直肠癌的作用是动态变化的，不同时期促进和抑制肿瘤生长相互交叉作用，最终抑制肿瘤生长。