高强度聚焦超声消融不同范围兔VX2乳腺癌的效应及转归实验研究

冯潇铃，王琦，杨敏，廖洪建，张志飞，杜永洪

超声医学工程国家重点实验室，重庆医科大学生物医学工程学院，重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016；*通信作者 杜永洪 duyonghong@cqmu.edu.cn

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率高，死亡率增长快，目前居全球癌症第1位[1]。常规乳房切除术创面较大，乳房外形受损严重，极大地降低了患者的生活质量[2]。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一种无创治疗肿瘤的综合治疗方式[3-4]，其治疗实体性肿瘤按照外科原则从体外全覆盖、超范围切除体内肿瘤病灶，对于部分因肿瘤体积大、侵犯重要血管或器官而失去外科手术机会的患者，能从体外原位杀灭体内肿瘤细胞、减轻晚期肿瘤疼痛。HIFU技术通过结合药物化疗等综合治疗方式能有效延长患者的生存时间、提高其生活质量[5-6]。

由于乳腺位置表浅，体积较大的乳腺肿瘤进行HIFU完全消融时需要较大的超声能量，长时间辐照易导致患者不耐受或皮肤烧伤、水肿等[7]。此外，因高龄、晚期乳腺癌患者耐受性差及治疗部位的特殊性，HIFU治疗存在不完全消融肿瘤的可能性或临床需求。本研究在超声监控下，通过HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌模型，开展生物学效应及转归等基础实验研究，比较机体免疫转归效应，探索HIFU不完全消融可能引发的凋亡或免疫机制，有望为临床上耐受性差或治疗部位特殊的晚期乳腺癌患者提供HIFU不全消融基础理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 健康雌性新西兰兔（4～6周，2.0～2.5 kg）购自重庆医科大学动物实验中心，VX2种兔由超声医学工程国家重点实验室提供，TUNEL试剂盒（碧云天C1086），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）鼠抗兔多克隆抗体（博士德生物科技股份有限公司），小鼠Ig-G二步法免疫组化试剂盒（四正柏科技股份公司），ELISA试剂盒（博士德生物科技股份有限公司），聚焦超声肿瘤治疗系统（JC200型，重庆海扶医疗科技股份有限公司，HIFU治疗头频率1.03 MHz，直径158 mm），超声诊断系统（MyLab Class C Advanced），光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2乳腺癌模型建立 采用包埋法建立兔VX2乳腺癌模型，于无菌条件下采用外科手术方式从VX2种兔保种处取长势良好、无坏死的鱼肉样肿瘤组织，切成1 mm3大小的肿瘤块，将其植入兔左侧第二对乳腺内，待肿瘤直径长至1.5 cm左右，通过超声以及病理学HE染色观察细胞结构以验证是否成功建立兔VX2乳腺癌模型[8]。

1.2.2 HIFU辐照 将35只成功建立的VX2乳腺荷瘤兔随机分为对照组（5只）和3个不同范围HIFU消融组（50%、80%及100%组，每组10只）。实验兔术前禁食、禁水并腹部脱毛，术前5 min经耳缘静脉麻醉后将其固定于治疗台上，使肿瘤部位完全浸入脱气水，使用机载超声对兔VX2乳腺肿瘤进行定位，并根据不同的消融范围制订相应治疗计划（50%、80%及100%），勾画出预消融范围。JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统以“点-线-面-体”的辐照方式对肿瘤进行消融，超声治疗头从肿瘤中心逐渐往边缘移动辐照，直至覆盖设定范围内的肿瘤。各组HIFU辐照参数一致，每只荷瘤兔每cm3的辐照剂量相同，仅消融范围不同。

1.2.3 肿瘤消融体积测量 采集各组辐照前肿瘤区、辐照后损伤靶区的超声图像，使用软件Microsea HIFU Measurement Software 1.0测量各组辐照前的肿瘤区近似体积及辐照后的强回声靶区近似体积，计算肿瘤消融率；然后通过肿瘤解剖学观察并测量实际消融体积，于术后即刻各组随机处死3只瘤兔解剖取材，将肿瘤沿声束轴方向最大剖面切开后，使用软件测量出各组HIFU消融前肿瘤体积与消融后靶区的凝固性坏死体积，计算各组肿瘤消融率。从两方面共同佐证HIFU不完全消融模型是否成功建立。

1.2.4 HE及免疫组化染色 HIFU消融14 d后各组随机处死3只瘤兔，取完整肿瘤组织，沿超声束入射方向从肿瘤中央切开肿瘤，每个肿瘤组织均选择最大径面（此处切片面积最大，体积具有代表性）制作组织切片。组织于多聚甲醛固定、石蜡包埋后制成石蜡切片，切片一部分行HE染色，观察消融后肿瘤组织的结构损伤及存活区域组织的病理学改变；另一部分行免疫组化PCNA及TUNEL染色，观察各组肿瘤细胞凋亡及增殖情况，以视野出现棕黄色或棕褐色细胞核颗粒为阳性标志。

1.2.5 肿瘤抑制情况观察 HIFU消融后观察各组荷瘤兔的自然生存时间，于术后14 d测量各组肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=（长径×短径2）/2。

1.2.6 ELISA检测血浆中免疫抑制因子表达 各组于HIFU术前、术后3、7、14 d采集兔耳缘静脉血，3 000 r/min离心5 min后收集上清备用。将稀释处理好的样本加入酶标板孔内，按照ELISA操作法进行孵育显色，最后使用酶标仪检测其OD值以检测血浆中IL-2R及TGF-β1的表达水平。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素或双因素（组别×时间）方差分析，采用Turkey或Sidak进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔VX2乳腺癌模型建立 建模后第14天即可于兔左侧第二对乳头处扪及一形状规则、大小均匀的球形肿块，经游标卡尺测得肿瘤平均大小为（1.63±0.46）cm3（图1A）。超声声像图见一均质的低回声球形团块，边界清晰，可见明显血流信号（图1B）。HE染色显示肿瘤细胞形态、大小各异，核仁肥大且数量较多，染色浓淡不均，间质内可见淋巴细胞浸润，具有肿瘤细胞的异型性表现（图1C）。

图1 兔VX2乳腺癌模型验证。A.建模第14天肿瘤组织外观；B.超声声像图见肿瘤内部有明显血流信号；C.HE染色（×200）见大小各异、排列紧密的肿瘤细胞

2.2 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌前后超声表现HIFU消融后肿瘤靶区可见明显超声回声增强（图2），3个消融组肿瘤区和消融靶区的超声声像图和解剖肿瘤测量体积比较见表1。各组由超声声像图测得的体积比与通过解剖肿瘤体积和凝固性坏死区测量的结果一致，两种方式测得的肿瘤消融率差异无统计学意义（50%、80%、100%组对应的F值分别为2.46、1.00、1.28，均P＞0.05）。

图2 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤前后各组超声声像图。A、B：50%消融组，C、D：80%消融组；E、F：100%消融组，其中A、C、E为HIFU辐照前，肿瘤边界清晰，表现为低回声，红色圆圈示肿瘤区；B、D、F为HIFU辐照后，消融靶区出现明显灰度增强，表现为强回声，红色圆圈示消融靶区

表1 HIFU消融不同范围兔VX2肿瘤组织后超声及解剖学测量肿瘤消融率比较（±s）

表1 HIFU消融不同范围兔VX2肿瘤组织后超声及解剖学测量肿瘤消融率比较（±s）

组别例数超声声像图观察肿瘤组织解剖学观察辐照前靶区体积（cm3）辐照后强回声区体积（cm3）消融率（%）辐照前肿瘤体积（cm3）辐照后损伤体积（cm3）消融率（%）50%消融组 10 1.58±0.15 0.83±0.04 52.67±0.15 1.77±0.13 0.94±0.13 53.24±0.07 80.43±0.13 100%消融组 10 1.64±0.17 1.66±0.08 100.32±0.15 1.83±0.37 1.84±0.49 100.38±0.17 80%消融组10 1.63±0.19 1.31±0.14 80.32±0.12 1.76±0.15 1.42±0.53

2.3 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌后HE染色表现光镜下显示对照组肿瘤细胞排列紧密，形态结构完整，染色均匀；各消融组肿瘤区均见不同范围的凝固性坏死表现，靶区与周围区见明显交界。50%消融组中央靶区表现为大片凝固性坏死，周围仍有大面积活性肿瘤细胞存在；80%消融组除中心靶区的凝固性坏死外，其交界区细胞质均质红染，部分呈空泡样变性，且出现大量的细胞核固缩裂解、核溶解以及大片的红染无结构区域；100%消融组肿瘤区全部呈凝固性坏死表现，周围无残瘤组织存在（图3）。

图3 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤后14 d各组肿瘤组织HE染色（×200）。A：对照组；B：50%消融组；C：80%消融组；D：100%消融组；各消融组靶区可见不同程度的细胞损伤，细胞核固缩、弥散、细胞间隙扩大，细胞结构丧失等，对照组可见细胞排列紧密、结构正常；箭示HIFU消融靶区

2.4 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌后免疫组化染色表现 光镜下可见各消融组均出现阳性染色的凋亡及增殖细胞（图4）。其中80%消融组PCNA阳性最少，TUNEL阳性细胞最明显，PCNA及TUNEL实验结果趋势均具有一致性。

图4 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤后14 d各组肿瘤组织PCNA、TUNEL染色（×200）。A～D：PCNA染色，棕黄染色为阳性表达，棕黄色越多表明细胞增殖越强；E～H：TUNEL染色，棕黄色越多表明细胞凋亡越明显；从左到右依次为对照组、50%消融组、80%消融组及100%消融组

2.5 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌后抑瘤能力评价HIFU消融兔VX2乳腺癌后14 d，100%消融组肿瘤组织全部发生凝固性坏死，坏死区肿瘤至28～35 d全部吸收；80%消融组的残瘤病灶在HIFU消融后引发细胞凋亡，在消融后14 d可见80%及100%消融组肿瘤体积减小，均明显小于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.001）。50%消融组残瘤面积较大，在消融后其肿瘤体积随时间呈增大趋势，至消融后14 d逐渐接近对照组，且与80%、100%消融组间差异有显著统计学意义（P均＜0.001）。各消融组同对照组相比生存期明显延长，其中100%及80%消融组的生存期远长于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），50%消融组与对照组差异无统计学意义（P=0.2957），见表2。

表2 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤后14 d各组抑瘤效果评价及生存时间比较（±s）

表2 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤后14 d各组抑瘤效果评价及生存时间比较（±s）

注：80%、100%消融组与对照组相比差异均有统计学意义，故仅比较其与50%组的差异；a与50%消融组相比，P＜0.0001；b与50%消融组相比，P＜0.05

组别例数肿瘤体积（cm3）生存时间（d）对照组 5 4.69±0.33 38.33±4.04 50%消融组47.67±5.03 80%消融组 10 0.88±0.09a 79.40±10.50b 10 3.53±0.29 100%消融组10 0.49±0.10a 90.67±4.16b F值 233.2 44.22 P值＜0.0001＜0.0001

2.6 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌后ELISA染色结果 HIFU消融兔VX2乳腺肿瘤后，80%及100%消融组的IL-2R及TGF-β1表达持续降低。对于IL-2R可观察到组别×时间交互作用显著（F=35.31，P＜0.001），见图5A，在HIFU消融后第14天，80%与100%消融组的IL-2R水平较对照组及50%消融组明显降低。对于TGF-β1也可观察到显著的组别×时间交互作用（F=79.82，P＜0.001），其在80%及100%消融组表达水平的下降趋势同IL-2R变化一致（图5B），而80%及100%消融组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌模型后14 d各组血浆肿瘤抑制因子ELISA结果。A：IL-2R表达水平；B：TGF-β1表达水平；* P＜0.05，** P＜0.001

3 讨论

3.1 HIFU技术 HIFU技术利用超声波的方向性、组织穿透性及可聚焦性，从体外精准、高效地消融体内实体肿瘤，目前已有大量研究证实其应用于骨肿瘤、乳腺癌等临床治疗疗效显著[9-11]。牛陵川等[12]通过基础研究证实HIFU辐照兔VX2乳腺癌肿瘤后，能有效抑制残留兔VX2乳腺癌肿瘤的生长和转移，延长荷瘤兔的生存时间，且有研究报道[13]当免疫佐剂联合HIFU局部消融时可刺激机体免疫效应，明显降低肿瘤转移率。

对临床上因肿瘤较大无法一次性完成消融或因皮肤破溃而不具备HIFU全消融条件的乳腺癌患者，采用HIFU不完全消融结合药物化疗等治疗方式，有望为其提供无手术创伤、低剂量化疗副作用小的综合治疗方案[14]。本文旨在为HIFU不完全消融技术的临床应用提供不同范围消融肿瘤后机体的免疫转归效应等实验研究理论基础。

3.2 超声声像图监控实现HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤 影像学监控是HIFU消融治疗中非常重要的环节之一，HIFU主要通过影像学监控手段实现对肿瘤不同范围的消融，超声图像的灰度变化可以很好地反映出肿瘤消融范围及肿瘤损伤情况，肿瘤诊断及治疗实施均通过超声监控实现[15]。本研究在超声声像图引导下对兔VX2乳腺肿瘤实施不同范围的HIFU消融，且发现通过超声声像图测得的肿瘤消融率与肿瘤解剖学测量的结果一致，为在超声声像图监控下行HIFU消融不同范围兔VX2乳腺肿瘤的可行性提供了数据支持。

3.3 HIFU不完全消融可改善预后并激活机体抗肿瘤免疫应答 HIFU局部消融肿瘤会出现不同的转归[16]，PCNA仅在增殖细胞及肿瘤细胞内高表达，是评价细胞增殖状态、判断肿瘤恶性潜能的一个重要指标，其联合TUNEL凋亡检测用于HIFU消融肿瘤后的转归评价。本研究HE染色及免疫组化结果显示，各HIFU消融组在消融后对肿瘤组织的损伤仅表现为肿瘤损伤范围不同，而消融后残瘤肿瘤组织的转归才是导致HIFU不同范围消融肿瘤发生不同预后的原因：100%消融组肿瘤全部凝固性坏死，随时间进展肿瘤逐渐全部吸收；80%消融组虽仍有部分残瘤肿瘤存在，但其周围存活病灶会在HIFU消融后引发肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖从而起到抑制肿瘤生长的目的；50%消融组由于残瘤面积较大、细胞凋亡作用不明显，肿瘤细胞仍持续性增殖导致肿瘤继续生长，可能与HIFU不完全消融可能激活的机体抗肿瘤免疫应答相关。

为进一步验证HIFU不同范围消融对机体免疫功能的影响，本研究通过ELISA检测各组肿瘤免疫抑制因子IL-2R及TGF-β1的表达水平，结果显示80%及100%消融组的IL-2R及TGF-β1水平明显下调，证实了HIFU消融范围达80%时可有效增强机体抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，其机制可能为：①HIFU主要依靠热效应损伤肿瘤组织，80%消融组在长时间的HIFU辐照下增加了能量沉积，能量除作用于靶区外，也因热传递对周围肿瘤产生损伤并诱发周围残瘤细胞凋亡[17-18]。②HIFU消融后靶区肿瘤细胞被破坏释放出大量蛋白碎片及抗原，引起多种细胞因子释放、肿瘤抑制因子减少，从而诱导机体抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长及转移[19-20]。而50%消融不能有效抑制肿瘤生长，反而出现促进肿瘤发展的趋势，可能是由于损伤组织较小，未有足够免疫原性物质产生；或是因为坏死组织位于病变中心，产生的免疫原性物质无法入血刺激机体免疫所致。

3.4 不足与展望 本文通过研究HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌模型后的生物学效应及机体免疫改变等，有望为耐受性差或治疗部位特殊的晚期乳腺癌患者提供HIFU不全消融基础理论参考。但本实验仅验证了HIFU不完全消融兔VX2乳腺癌的短期治疗效果，其对兔VX2乳腺癌肿瘤的长期抑制作用及抗肿瘤免疫应答等机制研究尚需在后续实验中进一步探索。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突