姜黄素预处理对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠肾功能及肾组织TLR-4/NF-κB通路蛋白表达的影响

陈思云，欧阳军，白晨倩，苏晨皓，崔琴琴，刘 丁，谢静涵，赵瑛瑛

1)郑州大学第二附属医院肾内科 郑州 450014 2)郑州大学医药科学研究院内分泌研究室 郑州 450001

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一组以短期内肾功能急剧减退为主要表现的临床综合征，近年来，其发病率及病死率都呈明显升高趋势，而有效治疗手段却依旧受限[1]。顺铂作为高效广谱化疗药物，可通过与肿瘤细胞DNA交联使复制及转录受损，从而达到抗肿瘤效果，但约30%的患者在使用期间会发生顺铂所致的AKI[2]。研究[3-4]表明，顺铂可通过产生大量氧自由基及活性氧，促进TNF-α、IL-1等炎症因子表达，激活核因子-κB(nuclear factor-κappa B，NF-κB)信号通路，促进细胞凋亡等多种途径损伤肾组织细胞，从而导致AKI发生，阻断或调节上述途径可减轻相应肾脏损伤。姜黄素作为一种提取自姜黄类植物根茎中的疏水多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种药理学活性[5]。既往研究[6]发现姜黄素可通过减轻炎症反应及氧化应激从而对腺嘌呤所诱导的慢性肾损伤大鼠起到保护作用。本研究用姜黄素预处理和构建AKI小鼠模型后，观察肾组织TNF-α、IL-18 mRNA和Toll样受体-4(toll-like receptor 4，TLR-4)/NF-κB通路蛋白表达的变化，探讨姜黄素的作用及相应机制，以期为AKI提供预防及治疗新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器顺铂、姜黄素购自美国Sigma公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，RNA提取液、引物、兔抗鼠TLR-4/NF-κB多克隆抗体等均购自武汉Servicebio公司。酶标检测仪(美国BioTeK公司)、全自动生化仪(南京三和仪器有限公司)、荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)、垂直电泳仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)、灰度分析软件(美国Alpha Innotech公司)。

1.2 实验动物、分组及处理健康雄性昆明小鼠40只，6周龄，体重(42±2) g，购自浙江维通利华实验动物有限公司，动物合格证书编号：20210609Abzz0619000746，饲养于郑州大学第二附属医院医学研究中心。每笼5只小鼠，自由进食及饮水。所有动物实验均符合郑州大学第二附属医院伦理委员会标准(伦理号：2021324)。小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为4组：对照组、模型组、低剂量组以及高剂量组，每组10只。每天每只小鼠需定时称重并灌胃1次，共10天。低、高剂量组分别给予姜黄素150、300 mg/kg灌胃，对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。灌胃第5天晚，对照组腹腔注射生理盐水，其余3组小鼠均给予单次腹腔注射顺铂7.5 mg/kg以诱导AKI模型[7]。

1.3 肾功能指标检测于实验最后1天麻醉处死各组小鼠，迅速取心脏血并分离双侧肾脏。血液离心后取血清，使用全自动生化仪进行血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平检测。

1.4 肾组织病理学观察取小鼠部分肾组织置于体积分数10%中性甲醛溶液中固定，包埋、切片后行HE染色，于光镜下观察肾组织病理变化。

1.5 肾组织MDA和SOD检测精确称取0.2 g鼠肾脏组织进行机械匀浆，离心后取上清液，余漩涡混匀、恒温水浴、分光光度检测等操作步骤按MDA、SOD检测试剂盒说明书进行。

1.6 肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达水平的qRT-PCR检测小鼠肾组织匀浆后取上清，使用试剂盒抽提总RNA，参照操作说明书行反转录及荧光定量PCR。以GAPDH为内参。TNF-α上游引物5’-CCCTCACACTCACAAACCACC-3’，下游引物5’-CTTTGAGATCCATGCCGTTG-3’；IL-18上游引物5’-TGAAGTAAGAGGACTGGCTGTGA-3’；下游引物5’-TTGGCAAGCAAGAAAGTGTCC-3’；GAPDH上游引物5’-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3’，下游引物5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3’。反应体系：qPCR Mix 7.5 μL+上、下游引物各1.5 μL+cDNA 2.0 μL，用无RNase的ddH2O补足体系至15 μL。反应条件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃30 s，共40个循环；95 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCT法计算目的mRNA表达水平。

1.7 肾组织TLR-4和NF-κB蛋白表达的Western blot检测提取肾组织总蛋白并用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量，沸水浴变性后上样行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，依次加入TLR4和NF-κB一抗(按1∶1 000稀释)、二抗(按1∶3 000稀释)，化学发光，扫描存档胶片。采用AlphaEase FC软件分析条带灰度值，并用目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值来表示目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学处理采用SPSS 25.0分析。各组小鼠Scr，血清BUN，肾组织MDA含量和SOD活性，肾组织TNF-α、IL-18 mRNA和TLR-4、NF-κB蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠肾功能指标比较与对照组比较，模型组和低剂量组小鼠Scr、血清BUN水平升高；与模型组比较，低、高剂量组小鼠Scr、血清BUN水平降低；与低剂量组比较，高剂量组小鼠Scr、血清BUN水平降低，见表1。

表1 各组小鼠肾功能指标比较

*：与对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与低剂量组比较，P<0.05

2.2 各组小鼠肾组织病理学变化见图1。对照组可见肾脏皮、髓质结构分明，肾单位形态正常，间质未见炎症细胞聚集；模型组可见大量肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性明显，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞出现坏死崩解，管腔挤压变形，腔内可见类蛋白管型，间质有炎症细胞聚集；低、高剂量组肾小管细胞肿胀变性、坏死脱落以及炎细胞聚集等损伤均较模型组减轻，且高剂量组改善更为明显。

2.3 各组小鼠肾组织MDA含量和SOD活性比较与对照组比较，模型组和低剂量组肾组织MDA含量升高、SOD活性降低；与模型组比较，低、高剂量组肾组织MDA含量降低、SOD活性升高；与低剂量组比较，高剂量组肾组织MDA含量降低、SOD活性升高，见表2。

表2 各组小鼠肾组织MDA含量和SOD活性比较

2.4 各组小鼠肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达的比较与对照组比较，模型组和低、高剂量组肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达水平升高；与模型组比较，低、高剂量组肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达水平降低；与低剂量组比较，高剂量组肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达水平降低，见表3。

表3 各组小鼠肾组织TNF-α和IL-18 mRNA表达的比较

2.5 各组小鼠肾组织TLR-4和NF-κB蛋白表达的比较与对照组比较，模型组和低、高剂量组肾组织TLR-4和NF-κB蛋白表达升高；与模型组比较，低、高剂量组肾组织TLR-4和NF-κB蛋白表达降低，且高剂量组降低更显著，见表4。

表4 各组小鼠肾组织TLR-4和NF-κB蛋白表达的比较

3 讨论

顺铂作为临床一线化疗药，在肺癌、睾丸癌、卵巢癌及宫颈癌等多种实体肿瘤中治疗效果显著，经肾小球滤过后，会以高出血液数倍的浓度聚集于肾小管，肾损伤程度及AKI发生率具有剂量依赖性[3-4]。除直接损伤细胞DNA外，当顺铂进入肾小管细胞时，可与内源性抗氧化剂谷胱甘肽结合，使氧化应激增加，造成线粒体功能受损[8]。此外，顺铂还可促进多种炎性细胞因子及趋化因子表达增加，招募炎细胞聚集于肾脏，同时激活多条细胞凋亡途径[9-10]。本研究采用顺铂单次腹腔注射法来制备AKI模型。与对照组比较，模型组小鼠肾功能指标Scr及血清BUN均升高，且光镜下可观察到肾小管细胞肿胀坏死、管腔明显变形、间质炎症细胞浸润等病理变化，提示AKI模型建立成功。

姜黄素作为一种亲脂性多酚化合物，可通过调节多种生物靶点(包括转录因子、生长因子、炎症介质、细胞因子和凋亡蛋白等)和细胞通路，发挥抗癌、抗炎、延缓衰老等生物活性[11]。既往研究[12]发现，缺血再灌注诱导的AKI可引起晚期肾脏纤维化，而姜黄素则可通过上调APPL1的表达和抑制Akt磷酸化从而减轻这种损害。本研究结果表明，与模型组比较，姜黄素预处理后，低、高剂量组Scr和血清BUN水平降低，高剂量组降低更明显，提示姜黄素对顺铂引起的肾脏损伤具有保护作用，且可能有剂量依赖性。MDA和SOD常被用于反应组织氧化应激损伤程度。前者作为脂质过氧化的降解产物，不仅反映组织中活性氧及脂质过氧化反应水平，还间接代表生物膜受自由基氧化损伤的程度；而后者作为生物体内重要的抗氧化酶之一，可清除体内自由基，修复受损细胞[13]。Chen等[14]构建的高尿酸血症小鼠模型中，姜黄素可有效抑制血清及肝脏中的黄嘌呤氧化酶，进一步恢复组织SOD活性，减少血清MDA积累。在本研究中，经姜黄素预处理后，低、高剂量组肾组织MDA含量均低于模型组，且两组SOD活性均升高，提示姜黄素同样能通过清除肾组织内活性氧，降低脂质过氧化反应，从而改善氧化应激，减轻肾脏损伤。

TLR-4广泛表达于白细胞及多种肾实质细胞，当与配体结合后，其下游NF-κB被激活，继而参与调节免疫反应、促进多种炎症介质表达[15]。既往研究[16]表明，在顺铂诱导的AKI中，肾实质细胞中TLR-4的激活可促进多种细胞因子产生，引起炎症反应，加重肾脏损伤。Benedetti等[17]发现，与单纯应用顺铂比较，顺铂联合TNF-α处理可使体外培养的肾小管上皮细胞损伤程度加重、死亡细胞增加，而TNF-α又是顺铂诱导肾组织炎症反应的关键上游调节因子，可协调多种促炎因子激活，诱导黏附分子表达，促进肾组织内炎症细胞募集。近年来，姜黄素在肾脏疾病应用方面受到广泛关注。有研究[18]通过构建高尿酸血症大鼠模型，发现姜黄素可能通过减轻氧化应激及调控NF-κB表达，减轻肾组织纤维化和炎症反应。Huang等[19]发现姜黄素可能通过抑制lncRNA PVT1表达，从而抑制JNK/NF-κB通路，缓解脂多糖诱导的脓毒症小鼠AKI。本研究结果表明，与对照组比较，模型组肾组织TLR-4和NF-κB蛋白，TNF-α和IL-18 mRNA表达升高，而经姜黄素预处理后，低、高剂量组以上指标均降低，高剂量组降低更明显，提示姜黄素可能通过抑制TLR-4和NF-κB蛋白表达、减少炎症因子产生从而减轻炎症反应，对顺铂诱导的AKI起到保护作用。

综上所述，姜黄素可通过增加肾组织SOD活性，降低MDA含量，抑制TLR4/NF-κB通路蛋白表达，减少TNF-α和IL-18等炎症因子产生，从而起到减轻氧化应激及炎症反应，保护肾功能等作用。该研究可为姜黄素用于AKI防治提供理论依据，但它是否还能通过其他途径发挥相应作用仍有待进一步研究。