三种有机磷阻燃剂对BEAS-2B细胞联合毒性的联合指数法测定

郝 蕴，吴珑婕，韩 培，王 佳，田咏梅

1)郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室 郑州 450001 2)电子科技大学附属医院(四川省人民医院)临床医学检验中心 成都 610072

有机磷阻燃剂(organophosphate flame retardants，OPFR)是近年来使用较多的阻燃剂，广泛应用于塑料、建材、纺织品、家具等各种工业生产中[1]。常见的22种OPFR可根据取代基的不同分为3大类：氯代烷基磷酸酯类(Cl-OPFR)、烷基磷酸酯类(Alkyl-OPFR)和芳基磷酸酯类(Aryl-OPFR)；多数OPFR具有急性毒性，具体毒性表现为生殖与发育毒性、基因毒性与致突变性、内分泌干扰性等[2]。此外，Cl-OPFR还有一定的神经毒性、脏器毒性[3]。人体同时暴露于多种OPFR，室内灰尘吸入是其进入人体的主要方式[2]。这些OPFR具有相似的化学结构，其联合效应可能呈现加和甚至协同效应[4]。但是，目前对其联合毒性的研究多集中在OPFR与其他环境毒物的联合，如与传统有机毒物[5]、重金属[6]、新兴污染物[7]联合等，而忽略了OPFR之间的联合效应。Chou和Talalay定义的联合指数(combination index,CI)法通过质量守恒定律中的中位效应方程，将药物之间以及药物代谢动力学之间建立联系，能够定性和定量描述联合作用[8]。“CompuSyn”是针对CI法开发的研究药物联合作用的量-效分析软件，可绘制细胞存活率-联合指数(Fa-CI)图，观察联合作用类型和强度随浓度变化的情况[9]。因此，本研究选择中国室内灰尘中检出占比较高的3种OPFR[10]，采用等价效应剂量比[11][即以化合物单独作用时的半数抑制浓度(IC50)之比为混合比]，将3种OPFR随机组合成二元或三元混合物，采用CI法探讨3种OPFR的联合效应，为评估OPFR的环境风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材磷酸三(2-正丁氧乙基)酯[Tris(2-butoxyethyl) phosphate，TBOEP；CAS：78-51-3]购自阿拉丁公司，磷酸三(2-氯丙基)酯[Tris(1-chloro-2-propyl) phosphate，TCIPP；CAS：13674-84-5]、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯[Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate，TDCIPP；CAS：13674-87-8]购自上海麦克林生化科技有限公司，3种化学品的纯度均>96%。CCK-8试剂盒(美国Targetmol公司)，RPMI 1640培养基(以色列Biological Industries公司)，二甲基亚砜(DMSO，北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ELx808酶标仪(美国BioTek有限公司)。

1.2 细胞培养永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，在含体积分数10%胎牛血清、青霉素/链霉素双抗混合液的RPMI 1640培养基的培养箱(37 ℃、95%湿度、体积分数5% CO2)中培养。每2 d进行一次传代培养。

1.3 3种OPFR培养BEAS-2B细胞后细胞活力的CCK-8法检测3种OPFR溶解于DMSO中，制备成母液，用培养基稀释至少6个浓度梯度。BEAS-2B细胞以5 000个/孔的密度加入96孔细胞培养板中，孵育14 h后，分别暴露于不同剂量的OPFR(每种OPFR单独或二元和三元混合)中48 h，加入CCK-8试剂孵育3 h，在450 nm波长下测定每组的吸光度(A)，依据公式：细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As：实验孔吸光度；Ac：对照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度)计算细胞存活率。每个剂量组设5个平行样。

1.4 3种OPFR二元或三元混合培养BEAS-2B细胞的联合效应分析CI的计算公式如下：

其中：D为单用剂量，Dx为联用剂量。CI>1为拮抗作用，CI=1为相加作用，CI<1为协同作用，CI<0.7则协同作用较强[9]。

采用等效线图定性判断OPFR二元混合物对细胞的联合效应。等效线图的x轴和y轴分别为构成二元混合物的组分A和组分B的剂量单位，在无相互作用的情况下，实验点将形成一条笔直的线，即加和线。若实验点落于加和线上方和下方，分别为拮抗和协同作用[12]。

1.5 数据处理采用GraphPad Prism 9对单个化合物及混合物的剂量反应曲线进行非线性拟合，采用CompuSyn对实验结果进行联合效应分析。

2 结果

2.1 3种OPFR单独和联合作用于细胞的毒性效应见图1。由图1A可知，3种OPFR的非线性回归拟合的浓度-反应曲线(concentration-response curve,CRC)的决定系数(R2)均高于96%，拟合效果较好。对BEAS-2B细胞毒性的大小依次为TDCIPP>TBOEP>TCIPP，其IC50分别为85.8、204.9、758.8 μmol/L。本研究将3种OPFR以等价效应(IC50)剂量比分别进行二元和三元混合。混合物的CRC见图1B，由图1B可知，4种混合物在低剂量浓度下细胞存活率的实测值均低于拟合的CRC，说明在该浓度范围内，混合物的毒性增强。

A：OPFR的单独细胞毒性效应；B：OPFR的联合细胞毒性效应(BD、BC、DC、BDC分别为TBOEP+TDCIPP、TBOEP+TCIPP、TDCIPP+TCIPP、TBOEP+TDCIPP+TCIPP的混合物组)

2.2 联合作用分析结果见图2。由图2A可知，Fa-CI图以不同颜色的平滑曲线展示4种混合物的CI值随细胞存活率(Fa)变化的情况。随着Fa的升高，CI值降低，在Fa高于50%(即在混合物浓度低于IC50的范围内)，4种混合物的CI值及其95%置信区间均小于1，说明混合物的各组分间的联合效应为协同作用(即3种OPFR的联合毒性表现为协同作用)；且随着混合物效应浓度的降低，协同作用具有增强的趋势。将IC50及以下的几个具体的效应点上的CI值以条形图(图2B)展示，混合物在Fa为97%、95%、90%的效应点上有较强的协同作用。在此3个效应浓度下做二元混合物的等效线图，如图3所示，TBOEP和TDCIPP、TDCIPP和TCIPP、TBOEP和TCIPP的实验点均落于对应的加和线下方，可判定为协同作用。等效线法和CI法的结果相同，说明CI法的适用性和准确性较好。

A：CI随Fa变化的趋势图；B：不同效应浓度下的CI值

图3 OPFR二元混合物联合毒性的等效线图

3 讨论

OPFR是多溴联苯醚等传统阻燃剂的替代品，因具有低烟、低毒、低卤、低成本和良好的阻燃效果而被广泛应用。但OPFR为添加型阻燃剂，其通过物理混合而不是化学反应的方式添加到聚合材料中，易通过挥发、浸出、磨损和溶解等方式释放到周围环境中[13]。目前，已在灰尘、室内外空气、水体、沉积物和土壤及生物体内检出多种OPFR[4,14-15]。其分布特点是：室内环境中的OPFR水平较高(室内灰尘中的OPFR水平平均可达8.81 μg/g)，可能与装修材料的缓慢释放有关[10]；灰尘中的OPFR水平远高于空气中，可能与大气压和OPFR的理化性质有关[3]。人体主要通过灰尘吸入OPFR[2]，进入体内的OPFR通过肝脏代谢，在细胞色素P450、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽转移酶等的催化下，经水解、脱氯、与葡萄糖醛酸、谷胱甘肽结合等代谢反应，最终被降解为磷酸二酯或磷酸三酯。非Cl-OPFR的代谢速率高于Cl-OPFR。OPFR具体的代谢通路和代谢产物还有待深入研究[3]。

本研究选取了中国室内灰尘中检出占比较高的3种OPFR，探讨其对人支气管上皮细胞的单独和联合毒性作用，为人体呼吸道暴露OPFR的风险评估提供参考。

本研究发现，TCIPP对BEAS-2B细胞的毒性作用远低于TBOEP、TDCIPP，可能对呼吸系统的影响较小。3种OPFR的IC50与其他文献报道略有不同，如：TBOEP对鼠肝细胞系H4IIE的IC50为170.9 μmol/L[16]，而对人肝癌细胞系HepG2的IC50为1 000 μmol/L[17]；TDCIPP 对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的IC50为100 μmol/L[18]；400 μmol/L的TCIPP造成人脐静脉内皮细胞20.56%的抑制率[19]等。造成IC50浮动的原因可能是由于实验条件的不同或采用的细胞系不同，提示不同细胞系可能对OPFR毒性作用的敏感性不同。

有研究[20]报道OPFR是室内污染的重要来源，人群正在长期、微量地接触多种OPFR。本研究将3种OPFR随机组合成4种混合物，对其进行联合作用分析，Fa-CI图及条形图显示，在低于IC50范围内，混合物的联合毒性表现为协同作用，且随着浓度降低，协同作用增强。表明3种OPFR在低剂量的情况下，更可能发挥协同的作用，使其组成的混合物的毒性增强。考虑到人群实际的暴露环境，OPFR这一联合作用特点，可能给人群带来更大的健康风险。

目前，有多种方法研究多个化合物的联合作用。传统的研究联合效应的方法是先建立数学模型预测混合物的毒性，再将预测的毒性与实验观察到的毒性比较，根据实际毒性偏离预测毒性的程度，判断联合作用的类型。在此理论的基础上，引入了特定效应点(IC50)上的指标判定法，如：危害指数法、毒性单位法等。根据混合物的各组分是否引起相同的生物响应，经典的预测模型分为浓度加和模型和效应加和模型，因此，预测混合物毒性需要对各组分的毒性作用机制有一定的了解[11]。此外，还可通过特定的实验设计(如析因设计)定性判断各组分间是否有相互作用[21]，如有关双酚a、壬基酚和己烯雌酚在基准剂量水平下的联合雌性效应的研究[22]。但析因设计只能定性判断联合作用，且往往只设置2～3个浓度水平，无法探讨联合作用类型随混合物浓度变化的情况，所得信息有限。

OPFR是新兴的环境污染物，对其毒性的作用机制尚有很多未知。本研究所选择的CI法是基于化合物相互作用的一般物理化学规律而建立的模型，避免了因选择预测模型不当而造成的偏倚，CI法不仅能定性判断联合作用的类型，在一定程度上量化联合作用的强度，还可根据Fa-CI图，在整个效应区间上观察联合作用类型随浓度变化的情况，提供了OPFR更多联合效应方面的信息。

本研究结果表明，在4种组合方式中，TBOEP和TDCIPP、TBOEP和TCIPP组合的协同作用较强。TCIPP、TDCIPP为氯基取代的OPFR，可与烷基取代的OPFR TBOEP产生更强的协同作用，提示氯基和烷基取代的OPFR可能在发挥毒性的作用机制上有相似的代谢通路，从而表现出更强的协同作用，后续需要更深入的研究，以探讨氯基和烷基取代的OPFR产生协同作用的机制。此外，虽然3种OPFR的联合效应均表现为协同效应，但其构成的三元混合物BCD却未表现出更强的混合毒性，可能是因为等价效应比混合的BCD的主要成分为TCIPP，其联合作用的表现接近于TCIPP和TBOEP、TCIPP和TDCIPP的联合效应。

一项对13种有机污染物的二元联合作用类型的研究[23]发现，TDCIPP和另一种常用的OPFR(磷酸三苯酯)具有协同毒性作用。本次研究也发现了TDCIPP和TBOEP、TCIPP存在协同作用，提示在常用的二十多种OPFR中[2]，可能有较多的组合具有协同作用。因此，应纳入更多种类的OPFR，研究其协同作用是否普遍发生。

总之，本研究结果提示TBOEP与TCIPP、TDCIPP具有协同作用，且在低浓度范围内协同作用更强。在环境风险评估中，应充分考虑不同OPFR间的协同作用，从而避免低估风险。