水通道蛋白4低表达通过抑制类淋巴系统功能对AD模型小鼠脑组织磷酸化Tau蛋白表达的影响

郝淼淼,田海燕,刘 晗,王义精,高莉娜,滕军放

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以磷酸化Tau(pTau)蛋白异常聚集为主要病理表现的神经退行性疾病[1],但其病理机制不明。既往研究[2-5]在多种疾病模型(创伤性脑损伤模型、帕金森病模型等)中发现脑内淀粉样蛋白的异常聚集可能与大脑内类淋巴系统清除功能障碍有关。类淋巴系统依赖于星形胶质细胞足突末端水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)，参与脑脊液的引流和脑组织内异常蛋白和代谢废物的清除[6-9]。有研究[10]发现AD患者大脑皮层血管周围AQP4表达减少,但AQP4低表达对AD的pTau蛋白形成和聚集的作用机制尚未阐明。作者构建AQP4+/-和C57小鼠AD模型，评估大脑皮层pTau蛋白和AQP4的表达对小鼠脑实质内pTau蛋白聚集及星形胶质细胞变化的影响，探究AQP4低表达促进AD模型小鼠大脑内pTau蛋白形成聚集的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器鼠源性Tau蛋白单体购自武汉华美生物工程有限公司，多聚甲醛固定液购自北京索莱宝有限公司，蔗糖甲醛溶液购自北京雷根生物技术有限公司，鼠抗pTau抗体、鸡抗GFAP抗体和山羊抗鸡IgY购自Abcam公司，兔抗AQP4抗体购自Sigma公司，山羊血清封闭液购自博士德公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG购自Cell signaling公司，Cy5结合驴抗鼠抗体、Cy5结合驴抗兔抗体购自Jackson Immunology公司，Hoechst33258购自上海碧云天生物技术有限公司，伊文思蓝(Evan blue,EB)染色液购自北京雷根生物技术有限公司。鼠源性Tau蛋白纤维体制备：将鼠源性Tau蛋白单体以1 g/L的浓度溶于缓冲液(Tris/PBS,60 g/L岩藻糖，pH 8.0)后，置2 mL EP管内密封，利用磁力搅拌机在37 ℃ 1 000 r/min的条件下搅拌7 d，用超声破碎机振荡45 s，将制备好的1 g/L的Tau蛋白纤维体冻存于-80 ℃冰箱。

1.2 实验动物及分组30只健康雄性C57BL/6J(C57)小鼠，6～8周，体重18～22 g，购自郑州大学实验动物中心，30只健康雄性AQP4+/-小鼠(在C57小鼠背景下靶向敲除部分AQP4基因产生，子代通过PCR技术进行基因分型，其所用引物为5’-CAGAGACACAGCGGGTAGAC-3’和 5’-TGTTCTAT TGTTGCTAAGAAGGC-3’)，6～8周，体重17～20 g，购自上海南方模式生物科技有限公司。实验分组：注射2.5 μL浓度为1 g/L的鼠源性Tau蛋白纤维体(制备方法见1.1)的15只C57小鼠和15只AQP4+/-小鼠为C57 Tau组和AQP4+/-Tau组。注射等体积PBS的10只C57小鼠和10只AQP4+/-小鼠为C57 PBS组和 AQP4+/-PBS组。5只C57小鼠和5只AQP4+/-小鼠用于类淋巴系统示踪检测。

1.3 构建AD模型将小鼠用异氟烷麻醉后，将浓度为1 g/L的鼠源性Tau纤维体2.5 μL缓慢注入小鼠前额叶皮层，以前囟为标志，注射坐标定位为前囟+0.8 mm,旁开+3.3 mm,深度-3 mm。注射完毕后留针3 min，缓慢拔出针头后无液体渗出，缝皮消毒，待小鼠清醒后状态良好，即模型构建成功[4]。对照组则分别在C57小鼠和AQP4+/-小鼠相同部位注射等体积的PBS缓冲液。

1.4 EB示踪C57和AQP4+/-小鼠大脑类淋巴系统小鼠经异氟烷麻醉后，向其小脑延髓池缓慢注射0.05 kg/L的EB溶液3 μL。将小鼠头部固定于立体定位仪上消毒，用剪刀剪开头部皮肤，暴露颅骨三角区，微量注射器缓慢注射EB于小脑延髓池，注射完成30 min后，经心脏灌注处死小鼠后取脑组织，10 μm厚冰冻切片，切片置于荧光显微镜下，观察小鼠大脑内示踪剂EB溶液在大脑内沿类淋巴系统引流分布情况，利用Image J半定量分析脑切片EB的残余荧光面积。

1.5 小鼠大脑内pTau蛋白表达的检测注射鼠源性Tau蛋白2个月后，将4组小鼠安乐死，取脑组织于多聚甲醛固定液中固定24 h，石蜡包埋,4 μm厚切片。脑切片经二甲苯脱蜡，浓度梯度的乙醇脱水，去离子水去除内源性过氧化物酶活性，置于柠檬酸钠中行高温高压以修复抗原，修复后用山羊血清封闭30 min,一抗(pTau抗体,按1∶300稀释)4 ℃孵育过夜，室温复温1 h，PBS清洗，辣根过氧化物酶标记的二抗(抗鼠IgG，按1∶500稀释)室温孵育40 min。DAB显色，树胶封片。光学显微镜下观察小鼠大脑皮层、纹状体。大脑皮层或纹状体以棕色颗粒样着色为阳性染色，以同一层面上pTau阳性染色面积占该层面总面积的百分比计算pTau蛋白阳性表达率。

1.6 小鼠大脑皮层星形胶质细胞标志物GFAP、AQP4和pTau蛋白的检测将小鼠安乐死后取脑组织，蔗糖甲醛溶液固定、脱水24 h，将脑组织用OCT包埋、切片，20 μm厚脑切片用Triton-100处理15 min,加50 g/L BSA封闭30 min，加兔抗AQP4抗体(按1∶600稀释)、鸡抗GFAP抗体(按1∶600稀释)、鼠抗pTau抗体(按1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS洗5遍，加Cy5结合驴抗鼠抗体(按1∶300稀释)、Cy5结合驴抗兔抗体(按1∶300稀释)、山羊抗鸡IgY(按1∶300稀释)避光室温孵育2 h，PBS洗5遍，Hoechst33258(按1∶1 000稀释)染核后甘油封片。荧光显微镜下观察，采用Image J软件分析模型小鼠脑实质内星形胶质细胞标志物GFAP的荧光强度，根据荧光染色强度评估星形胶质细胞GFAP与AQP4、pTau蛋白分布情况。

1.7 统计学处理采用SPSS 20.0进行分析。采用2×2析因设计的方差分析比较4组小鼠脑实质内pTau蛋白表达的差异；采用两独立样本的t检验对C57小鼠和AQP4+/-小鼠的类淋巴系统示踪剂EB的残余荧光面积和AQP4+/-Tau组、C57 Tau组GFAP表达的差异进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 C57与AQP4+/-小鼠类淋巴引流清除结果见图1。与C57小鼠([1.41±0.35)%]相比，AQP4+/-小鼠EB残余荧光面积[(8.04±0.55)%]减少(t=22.581，P<0.001)。

A:AQP4+/-小鼠;B:C57小鼠;1:大脑内残余EB示踪剂；2:Hoechst33258染核；A3:A1和A2合图；B3:B1和B2的合图

2.2 4组小鼠大脑皮层和纹状体pTau蛋白的表达见图2、表1。外源性Tau蛋白和敲除部分AQP4基因(AQP4+/-)均可增加C57小鼠大脑皮层和纹状体中pTau蛋白聚集；两因素具有协同作用。

A：AQP4+/- Tau组；B:C57 Tau组；C:AQP4+/-PBS组；D:C57 PBS组

2.3 C57 Tau组和AQP4+/-Tau组小鼠大脑皮层GFAP、AQP4和pTau蛋白的表达见图3。AQP4+/-Tau组小鼠大脑皮层中较多pTau蛋白聚集，周围伴有星形胶质细胞明显增多，AQP4表达减少；而C57 Tau组小鼠大脑皮层可见有pTau蛋白的少量聚集，周围伴有星形胶质细胞少量增多。C57 Tau组和AQP4+/-Tau组小鼠大脑皮层星形胶质细胞标志物GFAP表达量分别为(19.98±3.65)和(27.46±5.19)，差异有统计学意义(t=3.729，P=0.002)。

A、C：AQP4+/- Tau组；B、D:C57 Tau组；A1、B1：pTau表达；C1、D1：AQP4表达；2:GFAP表达；3:Hoechst33258染核；4:1～3的合图

3 讨论

AD病理表现为大脑内pTau的异常沉积[11-12]。大量研究[13-15]证实血浆和脑脊液中pTau的检测和大脑内pTau蛋白沉积量的PET分析有助于AD的早期预测和预后的改善。AD患者尸检发现血管旁星形胶质细胞周围AQP4表达量的减少，提示AD患者pTau的病理出现与大脑血管周围AQP4表达定位减少有关[10]。有研究[16]发现APP/PS1小鼠模型中AQP4缺失可加重大脑内β淀粉样蛋白的病理沉积。

本研究利用AQP4+/-小鼠构建AD模型，在其大脑皮层和纹状体检测到pTau的沉积，发现AQP4表达量的减少可明显加重pTau蛋白沉积。此外，我们发现AQP4+/-Tau组和C57 Tau组小鼠大脑皮层pTau沉积的附近有反应性星形胶质细胞增多。有研究[17]结果提示星形胶质细胞与大脑内病理性蛋白沉积相关，在AD患者和小鼠模型中，可发现星形胶质细胞反应性增多，促进病理性蛋白的异常沉积，出现钙动力学异常，加重有害物质的释放，进而损害神经元及突触的重塑。有研究[18]认为AD的发生与大脑类淋巴系统引流功能障碍相关。AQP4是参与类淋巴系统引流清除过程的水通道蛋白，AQP4的缺失可抑制大脑类淋巴系统清除，引起大脑内蛋白和代谢废物异常沉积。本研究利用EB示踪大脑类淋巴系统，发现AQP4+/-小鼠的残余示踪剂渗透少于C57小鼠，提示AQP4+/-小鼠出现了类淋巴系统清除障碍。

综上所述，AQP4低表达加速大脑皮层pTau蛋白形成和聚集的发生，可能与类淋巴清除功能障碍有关。但pTau聚集对AD小鼠AQP4表达的影响和抑制类淋巴功能障碍的分子机制还需要进一步探索。