基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的PD-1抑制剂治疗的晚期肺腺癌患者血清代谢组学研究

李 林，杨双宁，秦国慧，亓妍文，赵坤宇 ，王丽萍

1)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052

肺癌在全世界发病率高，是癌症死亡的主要原因[1-2]。虽然肺癌的治疗手段有多种，如手术、放化疗、靶向药物治疗等，但效果仍不理想，5 a的总体生存率较低[3]。近年来随着肿瘤免疫研究的不断发展，免疫治疗也逐渐用于临床并取得较好的疗效。以程序性死亡受体-1(programmed cell death 1，PD-1)和程序性死亡受体配体-1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)为代表的免疫检查点抑制剂的发展极大地改善了非小细胞肺癌的治疗前景[4-5]。PD-1/PD-L1抑制剂阻断抑制性信号的传导，恢复部分T细胞杀伤肿瘤细胞的能力[6]。代谢组学近年来发展迅速，被广泛应用于疾病的诊断、生物标志物发现和疾病机制研究，特别在癌症分子的诊断应用中发挥重要作用[7]。代谢组学可以用于肿瘤的诊断、治疗指导和预后判断。本研究对一线化疗失败但未使用PD-1抑制剂治疗的晚期肺腺癌患者在使用PD-1抑制剂联合化疗治疗前后的血清代谢物进行分析，寻找潜在的生物标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2020年6月至12月在郑州大学第一附属医院接受治疗的晚期肺腺癌患者14例，其中男8例，女6例。纳入标准：①年龄50～75周岁。②病理以及影像学确诊为晚期肺腺癌。③经化疗后复发或进展。④美国东部肿瘤协作组评分为0～1分。排除标准：①既往接受过免疫治疗或靶向治疗。②肝肾功能严重障碍。③严重血液系统疾病。所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器和试剂超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)系统：Ultimate 3000 UHPLC(美国戴安公司)，Q Exactive高分辨率质谱(美国赛默飞世尔科技公司)，ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国沃特世公司);CF16RN离心机(日本日立公司)；乙腈和甲醇(UPLC级，美国费希尔公司);甲酸(UPLC级，中国阿拉丁公司)。

1.3 差异代谢物的测定抽取患者第1次使用化疗联合PD-1抑制剂治疗前3 d的外周血(A组)及治疗2周期后外周血(B组)各2 mL于EDTA抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，置-80 ℃冰箱内保存。检测前，将血清置于冰上溶解并通过涡旋振荡均匀，取100 μL血清加入300 μL甲醇，再次涡旋5 min混匀后4 ℃、15 000 r/min离心10 min，吸取上清液进行分析。

色谱条件为ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱，流动相为体积分数0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速0.2 mL/min，进样量5 μL，柱温40 ℃。

质谱条件为电喷雾电离源，采用正、负离子监测模式，扫描范围80.00～1 200.00 m/z，分辨率17 500；正离子模式下喷雾电压和鞘气流速分别为3.50 kV和40 μL/min，负离子模式下为2.80 kV和38 μL/min；辅助气体温度为300 ℃，离子源温度为350 ℃，毛细管温度为320 ℃，辅助气体流量为10 μL/min。

1.4 统计学处理所有数据均通过Thermo Xcalibur 3.0(美国赛默飞世尔科技公司)进行处理。将原始数据导入Compound Discovery 3.0(美国赛默飞世尔科技公司)进行峰校准、峰匹配和峰对齐，将提取到的数据导入 SIMCA 14.0进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，将重要变量性投影>1、P<0.05的指标作为潜在标志物。治疗前后的数据运用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)进行配对资料的t检验以筛选差异代谢通路，P<0.05的代谢通路为差异代谢通路，并将潜在差异化合物的二级谱图与HMDB数据库进行比对鉴定。

2 结果

2.1 血清模式识别分析结果见图1。正负离子模式下PCA模型显示两组分隔较远无重叠；OPLS-DA模型显示两组样本点分隔远。正离子模式下，OPLS-DA 模型相关参数R2=0.988和Q2=0.890，负离子模式下R2=0.988和Q2=0.880，均大于0.5，说明模式识别可靠。

A：正离子PCA；B：负离子PCA；C：正离子OPLS-DA；D：负离子OPLS-DA

2.2 差异代谢物的筛选及鉴定正负离子模式下各选出80余种物质，通过比对鉴定出有差异的物质14种。其中谷氨酰丝氨酸、脯氨酸、犬尿氨酸、脱氢抗坏血酸、N-硬脂酰鞘磷脂、5-羟基吲哚乙酸水平升高，而色氨酸、亮氨酰脯氨酸、柠檬酸、硬脂酸、吲哚丙烯酸、丙酰肉碱、吲哚、3-甲基吲哚水平降低。图2为14种代谢物水平变化趋势热图。

图2 差异代谢物热图分析结果

2.3 差异代谢通路分析结果见表2。

表2 差异代谢通路分析结果

3 讨论

PD-1抑制剂通过阻断PD-1通路的激活，恢复部分T细胞功能，使这些细胞能够识别并杀伤肿瘤细胞[8-9]。T细胞的激活、分化和功能紧密依赖于氨基酸的运输和代谢[10]。肿瘤细胞不仅可以利用氨基酸进行增殖和侵袭，而且还能进行肿瘤免疫逃逸[11-12]。本研究共筛选出14种差异代谢物，1条可能与PD-1抑制剂作用相关的色氨酸代谢途径。色氨酸的分解代谢被认为是一种重要的微环境因子变化。色氨酸的耗竭是导致T细胞无能和凋亡的主要机制之一[13]。吲哚胺-2,3-双加氧酶是一种能够催化色氨酸转化为犬尿氨酸的酶[14]。色氨酸降解产物犬尿氨酸可以抑制树突状细胞抗原提呈功能，从而抑制T细胞的增殖[13]。此外，吲哚胺-2,3-双加氧酶可能参与了免疫检查点靶向治疗的主要耐药机制形成[15]。在本研究中，经PD-1抑制剂治疗后的晚期肺腺癌患者血清犬尿氨酸水平升高，色氨酸水平降低，犬尿氨酸/色氨酸比值升高。

肿瘤的发生是多种代谢通路共同作用的结果，目前，免疫治疗已经在临床上广泛使用，但是其作用机制还有待进一步探讨。该实验检测了经一线治疗失败的肺腺癌患者使用PD-1抑制剂联合化疗治疗前后的差异代谢物，分析了可能参与的相关代谢通路，发现犬尿氨酸/色氨酸比值可作为评估该类患者预后的潜在生物标记物。

另外，本研究存在一定的不足。首先由于免疫治疗费用较高，入组的患者少，样本数量不足；其次使用免疫治疗联合化疗不能排除化疗对差异代谢物及代谢通路的影响。今后还需要大量的样本及更严格的入组患者筛选条件进行验证。