高脂饮食对子宫内膜异位症小鼠异位病灶生长及FABP4蛋白表达的影响

陆 杰，杨 立，朱远航，张华文，杨 靖

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

子宫内膜异位症是育龄妇女常见的慢性妇科疾病，目前发病机制尚不明确，局限于激素或手术治疗，且治疗后复发率高。有学者[1]发现在育龄期女性中高脂饮食是子宫内膜异位症的高危因素。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白4(adipocyte fatty acid-binding protein 4，FABP4)是一种重要的脂质代谢因子，与机体脂肪含量相关，可导致肥胖[2]。我们前期的研究[3]表明：子宫内膜异位症患者血清及腹腔冲洗液中FABP4水平较高。本研究以子宫内膜异位症模型小鼠为研究对象，观察高脂饮食对小鼠异位子宫内膜增长及FABP4表达的影响，探究高脂饮食在子宫内膜异位症发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂SPF级雌性C57BL/6J小鼠[SCXK(豫)2017-0001]20只，均购自河南省实验动物中心,6周龄,体重18～20 g。小鼠饲养间昼夜交替12 h，环境平均温度为(23±2) ℃，平均相对湿度为(50±5)%，小鼠自由取食和饮水，适应性饲养1周。所有动物实验过程均遵循动物伦理学规范。高脂饲料(H10060，21.92 kJ/g，脂肪供能比60%)购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2019-0008]，普通小鼠生长维持饲料(16.11 kJ/g，脂肪供能比12%)购自湖南嘉泰实验动物有限公司[许可证号：SCXK(湘)2015-0010]。FABP4多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔、EDTA抗原修复液及DAB显色剂购自武汉Servicebio生物科技有限公司；核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抗体购自英国Abcam公司；过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ)抗体购自美国Affinity公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒均购自福州度一基地生物科技有限公司；苯甲酸雌二醇购自上海全宇生物科技有限公司。

1.2 子宫内膜异位症小鼠模型的建立术前1天小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg)，使所有实验小鼠处于同一动情周期。手术在无菌条件下进行。麻醉小鼠后，将其仰卧固定于实验台，腹部剪毛、消毒，于尿道上端沿腹中线切开1 cm左右，使用止血钳钝性分离左侧子宫，于靠近左侧卵巢及子宫Y形端两端结扎，取中间一段管状子宫后迅速放入盛有生理盐水的培养皿中，剪开管状子宫，留取中间完整5 mm×5 mm大小的子宫片。随后将切好的子宫片缝合于右侧腹壁固定，逐层缝合腹腔。术后1周内腹腔注射庆大霉素0.1 mL预防感染。建模后两周开腹、观察。小鼠移植物呈囊状小泡，表面有血管生成，表明造模成功，共18只小鼠建模成功，建模成功率90%。

1.3 实验分组及处理将建模成功后的小鼠分为两组：普食组和高脂饮食组，每组9只。普食组用普通小鼠生长维持饲料、高脂饮食组用高脂饲料饲养，自由取食，小鼠体重每周测量1次。

1.4 指标检测饲养8周后禁食和水5 h，取小鼠尾静脉血，-70 ℃保存。使用ELISA试剂盒检测两组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，按照说明书进行操作。颈椎脱臼处死小鼠，测量两组小鼠的体重、体长(鼻子至肛门的距离)，计算Lee′s指数[4]，打开小鼠腹腔，观察子宫内膜异位病灶，并用游标卡尺测量子宫内膜异位病灶的长、宽、高,计算子宫内膜异位病灶体积(mm3)=0.52×长×宽×高。随后将两组小鼠子宫内膜异位病灶分离，PBS液清洗后取0.3 g组织用于Western blot，剩余组织使用40 g/L多聚甲醛溶液固定，用于HE染色和免疫组化。

1.5 子宫内膜异位病灶组织的HE染色观察子宫内膜异位病灶组织固定24 h后，蒸馏水清洗，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，4 μm厚切片。依次使用二甲苯和梯度乙醇对组织切片进行脱蜡和水化，HE染色，脱水、透明后中性树胶封片，光镜下观察。

1.6 子宫内膜异位病灶组织中FABP4蛋白表达的检测取1.5中的组织切片，依次使用二甲苯和梯度乙醇对组织切片进行脱蜡和水化，体积分数3%双氧水溶液避光孵育25 min，PBS洗涤3次，血清封闭30 min。在切片上滴加一抗(FABP4多克隆抗体，稀释倍数1∶2 000)，于湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次。滴加二抗(HRP标记的山羊抗兔，稀释倍数 1∶200)，室温孵育50 min。PBS洗涤3次。滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，流水冲洗切片终止显色。苏木精复染细胞核。脱水，晾干，中性树胶封片。以PBS做阴性对照，已知阳性结果做阳性对照。免疫组化染色阳性结果判定：以细胞质中出现黄色或棕色颗粒为阳性表达。每张切片选择10个高倍镜视野(×400)，每个视野计数100个细胞，取10个视野的平均数： <5%为0分、5%～为1分、26%～为2分、>50%为3分。染色强度：无染色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕色为3分。取两项结果之和:0～1分为阴性(-)、2分为弱阳性(+)、3～4分为阳性()、≥5分为强阳性()。

1.7 子宫内膜异位病灶组织中PPARγ、NF-κB蛋白表达的检测采用Western blot法，将0.3 g组织标本转移至离心管中，加入裂解液，置于冰上用匀浆机充分研磨匀浆30 min，离心，提取上清液后，加入Buffer使蛋白变性，冷却离心，置-80 ℃冰箱保存备用。按照配方配制100 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶，放入加满电泳液的电泳槽中上样，进行SDS-PAGE电泳，转膜，50 g/L牛奶室温封闭1 h、一抗(PPARγ抗体稀释倍数1∶2 000，NF-κB抗体稀释倍数1∶1 000)4 ℃孵育24 h，次日用二抗( HRP标记的山羊抗兔，稀释倍数1∶5 000)孵育1 h，再次清洗，加入DAB显影剂显色。以GAPDH作为内参蛋白，用Quantity One软件对蛋白条带灰度值进行分析。以PPARγ、NF-κB 蛋白和内参条带灰度值的比值作为蛋白表达水平。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0进行分析。两组小鼠饲养8周后体重增加量、子宫内膜异位病灶体积、Lee′s 指数，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，子宫内膜异位病灶组织PPARγ、NF-κB蛋白水平的比较采用两独立样本t检验。两组小鼠子宫内膜异位病灶组织FABP4蛋白表达的比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠子宫内膜异位症模型建立情况两组小鼠子宫内膜异位病灶均生长良好，体积增大，呈隆起的暗红色或透亮的囊肿小泡，生长良好，其内充满液体，子宫内膜异位病灶周围血管丰富，部分病灶与周围组织粘连；HE染色可见两组小鼠异位的子宫内膜上皮细胞呈柱状、立方状或扁平状,以环形或锯齿状生长,间质中腺体数量减少,血管丰富,肌层结构不清晰(图1)。

A：普食组；B：高脂饮食组；1：大体，箭头示小鼠子宫内膜异位病灶；2：HE染色(×100)

2.2 两组小鼠体重、子宫内膜异位病灶体积、Lee′s指数建模前两组小鼠体重无差异，饲养8周后高脂饮食组小鼠体重增加量、Lee′s 指数均大于普食组(表1)。

表1 两组小鼠体重、子宫内膜异位病灶体积、Lee′s指数比较

2.3 两组小鼠子宫内膜异位病灶组织FABP4蛋白的表达FABP4蛋白主要在小鼠异位的子宫内膜腺上皮细胞中表达(图2)。高脂饮食组小鼠子宫内膜异位组织FABP4蛋白的表达高于普食组小鼠(表2)。

A:普食组；B：高脂饮食组

表2 两组小鼠子宫内膜异位病灶组织FABP4蛋白表达的比较 例

2.4 两组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与普食组比较，高脂饮食组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(表3)。

2.5 两组小鼠子宫内膜异位病灶组织PPARγ、NF-κB蛋白的表达与普食组比较，高脂饮食组小鼠子宫内膜异位病灶组织PPARγ蛋白的表达降低，NF-κB蛋白的表达升高(表4)。

表4 两组小鼠子宫内膜异位病灶组织PPARγ和NF-κB蛋白表达的比较

3 讨论

高脂饮食会导致机体营养过剩和脂质代谢紊乱，使机体内脂肪积聚，从而导致肥胖的发生。已有研究[5]表明，脂肪组织不仅是机体的能量储存器官，还是重要的内分泌器官，能够分泌瘦素、脂联素等脂肪因子，可溶性细胞间黏附分子(sICAM-1)、血管细胞黏附分子(VCAM)等黏附分子，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胎盘生长因子(PIGF)等趋化因子，在维持机体内环境稳态、炎症等方面起到重要作用。有研究[6-8]发现瘦素、脂联素等脂肪因子、sICAM-1、VCAM等黏附分子和VEGF、FGF、PIGF等趋化因子可以促进子宫内膜组织在腹腔内黏附、侵袭和血管生成，导致子宫内膜异位症的发生。子宫内膜异位症是一种激素依赖性疾病，而脂肪组织可以促进雌、雄激素之间相互转化，是除卵巢外雌激素的重要来源[9]。本研究结果表明高脂饮食组小鼠饲养8周后体重增加量、Lee′s指数和子宫内膜异位病灶体积大于普食组小鼠，提示高脂饮食促进了小鼠子宫内膜异位病灶的增长。临床研究[10]表明，与非子宫内膜异位症妇女比较，患有子宫内膜异位症的妇女BMI偏低。Ferrero等[10]研究发现在子宫内膜异位症患者中存在脂质功能障碍和脂肪流失的现象。一项关于子宫内膜异位症小鼠模型的研究[11]发现子宫内膜异位症可降低小鼠体重和体脂水平。以上研究结果表明子宫内膜异位症与BMI呈负相关，与我们的结果不一致。这可能与行为因素有关，如子宫内膜异位症的慢性疼痛，以及伴随的胃肠道紊乱(恶心和腹泻)，导致食欲不振从而导致体重降低。最新研究[12]结果表明，子宫内膜异位症会减少机体脂肪干细胞，并通过microRNA诱导的脂肪细胞代谢基因表达的改变，导致机体低脂肪的倾向，提示低BMI是子宫内膜异位症的结果。肥胖对子宫内膜异位症的影响尚无定论。

FABP4是成熟脂肪细胞的重要细胞溶质蛋白，在脂肪组织中高度表达，在脂类代谢紊乱和炎症疾病的发生中发挥着重要作用。血清FABP4 水平与代谢疾病和肥胖的严重程度成正相关[2]，即高脂饮食会导致FABP4的表达升高。Zhu等[13]发现，FABP4在增生期和分泌期子宫内膜上皮细胞、分泌期基质细胞中表达，沉默或选择性抑制FABP4会抑制子宫内膜上皮细胞增殖、迁移和侵袭，FABP4在维持子宫内膜细胞功能中具有重要作用；他们还指出FABP4可能还参与了子宫内膜病变的发生发展，如功能失调性子宫出血、子宫内膜增生、子宫内膜癌、子宫内膜异位症和子宫腺肌症。陈勇等[14]的研究显示与非子宫内膜异位症患者比较，子宫内膜异位症患者的血清和异位的子宫内膜组织中FABP4表达水平均上升，并且血清FABP4水平与子宫内膜异位症分期和血清CA125水平密切相关，证实FABP4在子宫内膜异位症中发挥重要作用。有研究[13]认为子宫内膜细胞中FABP4的表达含量与机体雌、孕激素水平有关。本研究结果表明高脂饮食组小鼠子宫内膜异位病灶FABP4蛋白的阳性表达高于普食组小鼠，提示高脂饮食促进小鼠子宫内膜异位病灶组织FABP4的表达，从而促进小鼠子宫内膜异位病灶的生长。

有报道[15]指出，PPARγ是FABP4的一个靶基因，FABP4可以负反馈调节PPARγ水平。PPARγ能够负反馈调节NF-κB活性[16]。NF-κB是子宫内膜异位症的重要转录因子，可以促进子宫内膜异位细胞增殖[17]。子宫内膜异位症的发展依赖于NF-κB的激活，NF-κB参与异位的子宫内膜细胞增殖活化、迁移侵袭、血管生成等多种病理生理过程[18]；并且激活NF-κB可诱导多种炎性因子、抗细胞凋亡因子等的释放[19]，参与子宫内膜异位病灶组织形成过程中发生的炎症反应，从而促进子宫内膜异位症的发生发展[20]。本研究结果也显示与普食组小鼠比较，高脂饮食组小鼠子宫内膜异位病灶组织PPARγ蛋白降低，NF-κB蛋白升高，高脂饮食组小鼠体内炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，表明高脂饮食可促进子宫内膜异位症小鼠FABP4的表达，并可能通过抑制PPARγ的表达和激活NF-κB的表达促使炎症的产生，从而促进子宫内膜异位症的发展。

综上所述，高脂饮食能通过促进小鼠子宫内膜异位病灶组织FABP4蛋白的表达，从而进一步促进子宫内膜异位症的发展，其机制可能与抑制PPARγ表达和激活NF-κB有关。