青贮密度和青贮时间对紫花苜蓿发酵品质及营养成分的影响

郝俊峰， 于浩然， 贾玉山， 王志军， 格根图*， 李宇宇， 孙 林

(1. 内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室， 内蒙古 呼和浩特 010019； 2. 内蒙古农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)富含蛋白质和多种矿物质等营养成分，栽培历史悠久，适口性好，有“牧草之王”[1-2]之称。苜蓿加工方式有很多，干草调制是最为常见的方式，但这种方式因苜蓿二、三茬收获时恰逢雨季和茎叶干燥速度不一致等原因导致营养成分损失较大[3]。因此，为了避免减少苜蓿调制过程中营养成分损失，经过国内外学者多年的研究发现，制作青贮饲料是解决以上问题的理想措施[3-6]。与调制苜蓿干草相比，制作青贮饲料不仅不易受天气条件影响，而且可以有效地降低营养物质的损耗。研究发现制成青贮后的苜蓿蛋白质含量丰富，适口性良好，消化率极高，且易受家畜采食[3-4]。影响苜蓿青贮效果的因素较多，其中一个重要的因素是青贮密度。青贮密度过低导致青贮饲料的容量小，影响好氧微生物的生命活动和呼吸作用，导致乳酸菌发酵底物损失，从而加速青贮饲料中蛋白质的降解，进而影响青贮品质[7]。而密度太大会使得青贮料的温度过高，导致青贮料发霉腐烂，致使青贮料中营养物质流失，影响发酵品质[8]。青贮发酵品质除了受青贮密度的影响外，青贮时间的长短对青贮品质也有一定的影响。适宜的青贮时间可促进有益微生物在厌氧条件下更好的发酵，对改善青贮饲料的品质和提高饲料稳定性具有积极的影响[9-10]。目前，国内关于苜蓿青贮的研究多集中于添加剂种类或青贮密度对青贮品质的影响，而青贮密度和青贮时间交互作用的研究尚少见报道。因此，本试验选择青贮密度和青贮时间两个因素，旨在研究两因素及其交互作用对苜蓿青贮品质的影响，以期为苜蓿青贮的生产实践提供理论依据和参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以内蒙古鑫泰农业科技有限公司种植基地种植的第二茬紫花苜蓿(苜蓿处于初花期)为供试原料，品种为‘WL232HQ’紫花苜蓿。供试原料干物质为33.9%，粗蛋白含量为24.71%DM，中性洗涤纤维为42.00%DM，酸性洗涤纤维为35.54%DM，可溶性碳水化合物为4.87%DM。

1.2 试验设计

本试验采用双因素试验设计，分别为青贮密度和青贮时间。青贮密度设3个处理，分别为550，600和650 kg·m-3，用A1，A2，A3表示；青贮时间设3个处理，分别为30，60和120 d，用B1，B2，B3表示。将初花期的‘WL232HQ’紫花苜蓿刈割，留茬高度为8 cm，待含水量达到65%～70%时，切碎至2～3 cm，混合均匀，按照不同青贮密度称取紫花苜蓿原料，分别按3个密度称取275，300和325 g装入体积为500 mL聚乙烯青贮罐中，每个处理重复3次。于青贮第30，60和120 d进行开罐取样，分析其发酵品质和营养品质。

1.3 测定项目及方法

1.3.1营养成分指标 青贮开罐后称取120 g左右的样品于105℃杀青20 min后，于65℃烘48 h达到恒重。将烘干的青贮料分别经40目和100目过筛，装于自封袋保存，用于后续指标的测定。参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[11]对苜蓿的干物质(Dry matter，DM)、粗蛋白(Crude protein，CP)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)、可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)和粗脂肪(Ether extract，EE)进行测定。

1.3.2发酵品质的测定 青贮开罐后取10 g左右青贮样品，加入蒸馏水90 mL，充分搅拌，随后置于拍打式无菌均质器(JX-0.5，上海)中，拍打1 min，用4层纱布过滤后，中速定性滤纸过滤至离心管中，得青贮提取液，-20℃保存，用于下一步发酵品质的测定。取其中一部分提取液用HANNA pH 211型精密pH计测定pH值，氨态氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定[12]；另取一部分提取液经0.45 μm微孔滤膜滤过，上机检测。采用Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪测定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)及丁酸(Butyric acid，BA)，其中色谱柱为PSpak KC-811(8.0 mmID×300 mmL)，流动相为3 mmol·L-1高氯酸溶液，流速为1 mL·min-1，进样量为5 μL，检测波长为210 nm[10]。

1.4 数据分析与处理

采用SPSS 24软件中的一般线性模型进行Two-way ANOVA方差分析，采用Duncan法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同青贮密度和时间对紫花苜蓿发酵品质的影响

由表1可知，除乙酸和丁酸含量外，密度和时间的互作效应对苜蓿青贮的其他发酵指标有显著影响(P<0.05)。对pH值而言，在A1和A3密度下，B3处理的pH值显著高于B1和B2的样品(P<0.05)。而在A2密度下，B1的样品pH值最高；不同密度下的乳酸含量均随着青贮时间的延长呈先增加后减少的趋势，其中以A2B2处理组乳酸含量最高，且与其他处理差异显著(P<0.05)；A3密度处理的样品，乙酸含量显著高于A2处理(P<0.05)，其余处理间差异不显著；丙酸含量以A1B1处理组最高；丁酸含量只有A2B1，A2B2以及A3B2处理组中未被检测到，其余处理组均被检测到；在A2和A3密度下，氨态氮/总氮随着青贮时间延长呈先降低后升高的趋势。其中A2B2组样品氨态氮/总氮最低，显著低于其他处理组(P<0.05)。

表1 青贮密度和时间对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响Table 1 The effect of ensiling density and time on fermentation quality of alfalfa silage

2.2 不同青贮密度和青贮时间对紫花苜蓿营养品质的影响

由表2可知，各处理组的营养成分变化不一致。除CP含量外，密度和时间的互作效应对苜蓿青贮后的营养成分影响显著(P<0.05)。对DM含量而言，在A1和A2密度下，B2处理的DM含量高于B1和B3的样品，而在A3密度下，B1处理的样品DM含量最高；A1和A2密度处理的CP含量随着青贮时间的延长呈增加趋势，其中以A2B3处理组样品CP含量最高；NDF和ADF含量以A1B1处理组最低；不同密度处理下，WSC含量随着青贮时间的延长呈上升趋势。而B3处理的WSC含量随着青贮密度的增加呈下降趋势；在A2和A3密度下，EE含量随着青贮时间延长呈上升趋势，而A1密度则呈下降趋势。

3 讨论

3.1 青贮密度和青贮时间对苜蓿发酵品质的影响

在调制青贮饲料过程中，装填密度是决定青贮饲料加工成功是否的关键因素[13]。合理的青贮密度有利于罐中空气的排出，营造一个良好的厌氧环境，抑制有害微生物的生长，促进乳酸菌更好的发酵。青贮饲料发酵过程中，乳酸产生、pH值下降速度加快是抑制梭状芽胞杆菌的生命活动、减少发酵过程中蛋白质分解的主要因素[12]。本试验各密度处理组均以青贮60 d时，pH值最低，同时乳酸含量较其他处理组最高，发酵效果较好，说明较低的pH值对提高苜蓿发酵品质起到了积极促进作用[14]。此外，氨态氮与总氮的比值在青贮过程中也起着不可或缺的作用，一方面体现了青贮发酵过程中蛋白质的降解程度，另一方面还是影响青贮饲料氮在反刍动物瘤胃中利用效率的重要因素之一[15-16]。青贮密度为600 kg·m-3时，青贮30，120 d处理氨态氮/总氮较高，表明蛋白质的分解程度较高，这与王木川等[3]、Braman等[14]研究结果相同。

表2 青贮密度和时间对苜蓿青贮饲料营养品质的影响Table 2 The effect of ensiling density and time on nutritional quality of alfalfa silage

青贮的本质是原料通过乳酸菌发酵分解糖类，产生了乳酸以及部分乙酸，使得pH值降低，抑制微生物的生命活动来达到长期保存青饲料的目的[16]。因此，发酵品质的好坏直接反映了青贮品质，而发酵品质中乳酸含量、pH值及丙酸含量是决定发酵品质的关键指标。本研究中，随着青贮时间的延长，乳酸含量先增加后减少，乙酸含量略显增加，丙酸含量呈下降趋势，其中青贮60 d时，乳酸含量最高，发酵效果较好，这一结果与邹诗雨等[17]研究相一致，说明乳酸含量越高发酵越有效，同时丙酸含量和pH值越低，则越有益于抑制青贮过程中有害微生物的生命活动，进而保证了青贮品质。

3.2 青贮密度和青贮时间对苜蓿营养品质的影响

充足的WSC是饲料青贮的关键因素，同时为乳酸菌的繁殖提供了足够的营养底物[18]。本研究中，紫花苜蓿的WSC含量为4.87%DM，低于青贮玉米的WSC含量[19]，其原因为本研究试验材料为紫花苜蓿，WSC含量低为豆科牧草苜蓿的本身属性。同时，本研究所在区域为河套平原盐碱地，土壤中的盐胁迫也会对苜蓿中的WSC积累起着抑制作用[10,20-21]。在青贮过程中，青贮容器内的空气存量会影响微生物的活动和呼吸作用，从而造成青贮料中的营养成分和这乳酸发酵底物的损失[3]。本试验发现紫花苜蓿青贮时间60 d的处理组中，随着青贮密度的增加，WSC含量呈先迅速降低后逐渐上升趋势，即WSC含量减少量逐渐降低，其原因为青贮早期苜蓿中WSC含量较高，为乳酸菌的发酵提供了丰富的营养物质[22]，使得乳酸菌活跃产生大量乳酸，伴随青贮密度的增加，pH值逐渐趋于稳定状态，从而减少了对WSC的消耗量[23]。

在密闭条件下，青贮料中的乳酸菌逐渐占领优势，使得青贮发酵进入乳酸发酵过程，这一过程时间越短、乳酸发酵越有效，青贮品质也越好[16]。Zhang等[24]研究发现羊草青贮30 d后，由于乳酸菌发酵，CP和WSC含量下降。本试验发现密度为650 kg·m3、青贮60 d的样品CP和EE含量较青贮30 d有所增加，DM含量有所减少。CP含量增加可能是因为乳酸菌在青贮发酵过程中消耗了WSC等营养物质，DM含量逐渐减少，表现出苜蓿青贮随着时间延长，CP含量相对增加。此外，微生物蛋白含量相对较高，达50%～60%，在发酵过程中乳酸菌等微生物不断繁殖，也有提高青贮CP含量的作用[17,25]。

本试验中，随着青贮时间的延长，各密度处理下的CP含量较供试原料(24.71%DM)都有所降低，其原因为青贮过程中腐败微生物梭菌分解了青贮原料中硝酸盐、亚硝酸盐以及氨基酸，产生了氨态氮，这些生物活动都会消耗青贮蛋白的含量[23,26]。本试验中，密度为550和600 kg·m-3、青贮120 d的样品DM含量较青贮原料(33.9%)下降最为明显，与Schmidt等[27]研究结果相一致。伴随着发酵过程中微生物的生长和繁殖，DM消耗量也随发酵时间增加而增大。由于发酵早期微生物的生命活动，通过消耗营养物质产生纤维素酶[28]，使得ADF和NDF下降较快，到发酵中期趋于稳定。

4 结论

本研究中，青贮密度和时间的交互作用对乙酸和CP含量无显著影响，对其他所有成分有显著影响。综合比较，密度为600 kg·m-3、青贮60 d时，‘WL232HQ’紫花苜蓿青贮料中保留了较好的营养价值。测定指标pH值、丙酸和氨态氮/总氮值较低，乳酸含量较高，DM和CP含量较高，青贮效果最佳。因而，此组合也为最优组合。