ABA和GA3对山韭种子萌发、生理特性及内源激素含量的影响

胡国富， 李韦瑶， 肖汇川， 崔国文， 宋 雪， 韦银珠， 苏滢淼， 秦立刚

(东北农业大学动物科学技术学院， 黑龙江 哈尔滨 150030)

山韭(AlliumsenescensL.)为百合科葱属多年生草本植物，也有山葱和岩葱之称[1-2]。山韭具有很多的优良特性，如:适应能力强，即使是在干旱、贫瘠的地区也能保持良好的生长[3-4]；分布范围广，通常分布于欧洲、中亚地区、西伯利亚和中国北部，生长于海拔2 000 m以下的地区[5]；可食用，山韭生长在营养期，尤其是在结实阶段，鳞茎、嫩叶和小花均可食[6]，各类家畜均喜食，特别在结实阶段，是绵羊、山羊骆驼等的主要抓膘牧草；营养丰富，在各生育期均富含较高的蛋白质，是肥育牲畜的良好牧草[7-10]。

植物生长调节剂对植物种子的萌发具有明显的促进作用，但植物生长调节剂的种类、含量水平和浓度比例对于种子萌发的促进效果不同[11-12]。研究表明，不同浓度的脱落酸(Abscisicacid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA3)浸种均对种子萌发有促进作用。ABA是广泛存在于植物体不同组织中且具有多种功能的激素，在种子休眠、生长发育等方面起着重要作用[13]。ABA对光皮桦(BetulaluminiferaWinkl)[14]、燕麦(AvenasativaL.)[15]、水稻(OryzasativaL.)[16]等种子的萌发有明显的促进作用。GA属于双萜类物质，它能促进细胞分裂和细胞伸长，加速叶芽生长，影响植物淀粉酶等代谢酶的活性，有效打破种子休眠[17]。GA3能有效打破兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)[18]、滇油杉(KeteleeriaevelynianaMast.)[11]、杜鹃红山茶(CamelliaazaleaWei)[19]等种子的休眠。在利用山韭种子作为外植体进行组织培养体系建立过程中发现，长期保存后的山韭种子在萌发过程中存在发芽率较低、发芽势较差等问题，而在已有研究中，关于植物生长调节剂对山韭种子萌发影响的研究较少，因此本试验通过研究不同浓度的植物生长调节剂对山韭种子萌发特性、相关酶活性和内源激素含量的影响，揭示植物生长调节剂促进山韭种子萌发的生理影响途径，以期为山韭组培和遗传转化体系建立及大面积推广栽培利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1种子 供试材料为成熟的山韭种子，种子收获于2019年9月东北农业大学草业科学试验田(126°73′ N,45°75′ E，海拔134 m)。收获后风干脱粒，清选籽粒饱满的山韭种子置于4℃冰箱保存。千粒重约为2.03 g，含水量约为6.77%。

1.1.2试验试剂 试验中所用的ABA和GA3均购于博奥拓达公司。

1.2 试验设计

表1 植物生长调节剂的浓度处理Table 1 Treatment concentrations of plant growth regulators

1.3 测定方法

1.3.1萌发指标 种子萌发试验持续15天，在第7天计算山韭种子的发芽势，在第15天计算发芽率、发芽指数、活力指数和苗鲜重，并计算活力指数，每天上午统计发芽数。有关计算公式如下：

发芽势(%)=

(7天内正常发芽的种子数/供试种子总数)×100%

发芽率(%)=

(15天内正常发芽的种子数/供试种子总数)×100%

发芽指数=∑(Gt/Dt)

活力指数=GI×S

式中：Dt表示在t日的发芽数；Gt表示相应的发芽天数，S为萌发结束时鲜苗的平均芽长(mm)。

1.3.2胚根、胚芽长度及胚根、胚芽鲜重 15天发芽结束后，将山韭幼苗用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分。每个处理随机取10株测量胚芽长、胚根长和胚根胚芽的鲜重。

1.3.3生理指标测定 可溶性蛋白(Soluble protein，SP)和可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量，淀粉酶(Amylase，AL)、脂肪酶(Lipase，LPS)和中性蛋白酶(Neutral protease，NP)活性，均采用苏州科铭生物技术有限公司测定试剂盒进行测定。

1.3.4内源激素的测定 吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、ABA,GA3和乙烯(Ethrel，ETH)含量均采用上海酶联生物科技有限公司试剂盒进行测定。

1.4 数据分析

数据统计及图表制作采用Microsoft Office Excel 2010软件，采用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行显著性方差分析并进行差异显著性检验(Duncan)，主成分分析及相关性分析采用Origin 2021软件。

2 结果与分析

2.1 ABA和GA3处理对山韭种子发芽的影响

由表2可知，与CK(对照)处理相比，ABA处理显著提高了山韭种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数(P<0.05)。随着ABA浓度的升高，山韭种子发芽势和发芽指数呈先上升后下降的趋势，均在ABA浓度为100 mg·L-1时达到最高，分别为33.33%和32.77。随着ABA浓度的升高，山韭种子的发芽率与CK处理相比总体呈现升高趋势，在浓度为100 mg·L-1时达到最高84%。ABA浓度为50 mg·L-1时山韭种子的活力指数达到最大值，显著高于其他浓度(P<0.05)，之后随ABA浓度的升高，山韭种子的活力指数则有不同程度的降低。

表2 ABA处理对山韭种子萌发的影响Table 2 Effects of ABA treatments on seed germination of Allium senescens L.

由表3可知，随着GA3处理浓度的升高，山韭种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均呈先升高后降低的趋势。100 mg·L-1的GA3处理下，山韭种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数与CK相比均有显著提升(P<0.05)，且均在GA3浓度为100 mg·L-1时达到最大值，分别为20.67%，79.33%，26.37，1 081.30。当GA3浓度增加到200 mg·L-1时，发芽势、发芽指数和活力指数均有显著下降(P<0.05)，发芽势、发芽率和活力指数均随GA3浓度的增加而下降，当GA3浓度增加到800 mg·L-1时，发芽势、发芽率和活力指数降到最低，分别为2.67%，54.67%，184.54。

表3 GA3处理对山韭种子萌发的影响Table 3 Effects of GA3 treatments on seed germination of Allium senescens L.

2.2 ABA和GA3处理对山韭胚根和胚芽的影响

不同浓度的ABA处理对山韭胚芽和胚根影响不同。从图1A可知，ABA处理对山韭胚芽和胚根长有显著影响(P<0.05)，山韭胚芽长和胚根长均在ABA浓度为50 mg·L-1时达到最大值，分别为42.67 mm，12.67 mm，且胚芽长显著高于CK。而当ABA升高到75 mg·L-1时，胚芽长和胚根长则降低到最低，分别为22.33 mm，2.33 mm。随着ABA浓度的升高，胚芽重与CK相比有所增加(图1B)。其中，当ABA浓度增加到50 mg·L-1时，胚芽重显著高于CK且达到最大值为0.162 g(P<0.05)，胚根重也在此时达到最大值，为0.003 0 g。而当ABA升高到75 mg·L-1时，胚根重显著低于CK且下降到最低(P<0.05)，为0.001 1 g。图1C表明，随着ABA浓度的增加，山韭胚芽胚根长比和胚芽胚根重比总体呈上升后下降的趋势。当ABA升高到75 mg·L-1时，胚芽胚根长比和胚芽胚根重比均达到最高，分别为12.42，17.64。其中，胚芽根长比总是大于胚芽胚根重比。

图1 ABA和GA3处理对山韭胚根和胚芽生长的影响Fig.1 Effects of ABA and GA3 treatments on seedling growth of Allium senescens L.注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，CK为对照组，下同Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05),CK is the control group,the same as below

由图1可知，不同浓度的GA3处理下的山韭胚芽和胚根生长情况不同，GA3处理对山韭胚芽和胚根有显著影响(P<0.05)。图1D表明，随着GA3浓度的增加，山韭胚芽和胚根长呈先升高后降低的趋势，当GA3浓度增加到50 mg·L-1时，山韭的胚根长与CK相比显著增加且达到最高(P<0.05)，其值为41 mm；而当GA3浓度增加到100 mg·L-1时，与CK相比，山韭的胚芽长显著增加且最高，值为20 mm。由图1E可见，当GA3浓度为100 mg·L-1时，胚根重升高到最大值，为0.003 3 g。当GA3浓度升高到400 mg·L-1时，胚根重显著低于CK且最小(P<0.05)，为0.000 3 g。山韭胚芽胚根长比和胚芽胚根重比在随GA3浓度的增加呈先下降后上升的趋势。当GA3浓度为100 mg·L-1时，胚芽胚根长和胚芽胚根重的比值最接近，且此时胚芽胚根重值最低，为2.30。当GA3浓度为800 mg·L-1时，胚芽胚根长比和胚芽胚根重比均达到最大值，分别为9.06，10.05(图1F)。

2.3 ABA和GA3处理对山韭胚芽生理指标和酶活性的影响

由图2可知，与CK相比，100 mg·L-1ABA处理和100 mg·L-1GA3处理下的山韭胚芽可溶性蛋白含量显著升高(P<0.05)，但二者之间无显著差异。而山韭胚芽可溶性糖含量在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3处理后均与CK相比没有显著变化(P<0.05)，但其含量均有增加。在酶活性方面：山韭胚芽的α-淀粉酶、β-淀粉酶、α+β淀粉酶在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3处理下，与CK间均没有显著差异，但均有上升趋势；而与CK相比，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3处理下脂肪酶和蛋白酶均有显著升高(P<0.05)，其中100 mg·L-1GA3处理下蛋白酶活性最高，值为9 867.79 μmol·min-1·g-1。

图2 ABA和GA3处理对山韭胚芽生理指标和酶活性的影响Fig.2 Effects of ABA and GA3 treatments on physiological and enzymatic activity of Allium senescens L.注：ABA为脱落酸，GA3为赤霉素，下同Note:ABA is abscisicacid,GA3 is gibberellins,the same as below

2.4 ABA和GA3处理对山韭胚芽内源激素含量的影响

由图3可知，100 mg·L-1ABA处理和100 mg·L-1GA3处理对山韭胚芽内源激素含量有显著影响。与CK相比，ABA处理后的山韭胚芽内源ABA含量显著降低，GA3处理后的内源IAA含量显著降低(P<0.05)。ABA和GA3处理下的山韭胚芽内源ETH含量与CK相比均有显著升高，且GA3处理下的ETH含量显著高于ABA处理(P<0.05)。ABA处理下的山韭胚芽内源GA3含量显著高于CK和GA3处理，而GA3处理下的内源GA3含量则显著低于CK(P<0.05)。

2.5 ABA和GA3处理下山韭种子萌发各指标的综合分析

由图4A可知，各指标主要集中在一、二、四象限，也就是分布在100 mg·L-1ABA处理和100 mg·L-1GA3处理之间。其中，胚芽胚根长比、GA3含量、胚芽胚根重比、胚芽重和IAA主要分布在100 mg·L-1ABA处理下，说明其相关性较强；而在100 mg·L-1GA3处理附近主要分布的是胚根重、胚根长、胚芽长、ABA和ETH，说明这几个指标之间距离较近，相关性也较强；在ABA和GA3处理下，β-淀粉酶和α+β淀粉酶之间距离很近，说明二者之间有很强的相关关系；发芽率、可溶性蛋白和α-淀粉酶之间距离较近，说明三者之间相关性较强。由图4B可知，发芽率与发芽势、发芽指数、活力指数、可溶性蛋白、α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶之间有极强相关性；发芽势与发芽指数、可溶性糖、α-淀粉酶之间有较强相关性；发芽指数与可溶性蛋白、可溶性糖、α-淀粉酶之间有很强的相关关系；活力指数与酶活性和可溶性蛋白之间有强相关性；胚芽长与胚根长、胚根重、ABA，ETH之间有很强相关性，而与胚芽胚根长比、胚芽胚根重比、IAA,GA3之间有很强的负相关关系；胚芽重则与胚芽长相反，它与胚根长、胚根重、ABA，ETH有强负相关性而与胚芽胚根长比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之间有强相关关系；胚根长、胚根重均与胚芽胚根长比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之间负相关；同时，ABA与IAA和GA3之间也负相关；IAA和ETH之间也有强的负相关性。

图3 ABA和GA3处理对山韭胚芽内源激素的影响Fig.3 Effects of ABA and GA3 treatments on endogenous hormone of Allium senescens L.注：IAA为吲哚乙酸，ETH为乙烯，下同Note:IAA is indole-3-acetic acid,ETH is ethrel,the same as below

3 讨论

除环境因子对种子的萌发有显著影响外，植物生长调节剂对种子萌发也有很大影响[22-23]。研究表明，低浓度的外源ABA处理可以降低内源ABA含量，从而促进种子的萌发和生长[24]。黄宇等[25]认为，适宜浓度的ABA可以显著促进水稻种子的萌发和幼苗生长。本研究表明，随着ABA浓度的增加，山韭种子的发芽指标和幼苗形态指标均呈先增加后降低的趋势，在ABA浓度达到100 mg·L-1时山韭种子的萌发情况达到最佳。GA3作为一种信号物质，对种子萌发有显著地促进作用，主要有加速细胞分裂、促进成熟细胞伸长的作用[20,26-27]。本研究表明，50～800 mg·L-1GA3浸种处理对山韭种子的萌发和幼苗生长表现为低浓度促进，高浓度抑制的效果。这与李超等[28]对灯笼树(EnkianthuschinensisFranch.)种子萌发的研究结果相同。

种子成熟的过程中会积累大量的可溶性糖、可溶性蛋白等贮藏物质，当种子打破休眠开始萌发时，就会消耗种子内部的可溶性糖和贮藏蛋白[29]。而贮存物质分解需要酶的参与，因此，与贮存物质分解有关的酶活性增加是促进种子萌发的重要原因[30]。吴玉香等[31]在对西洋杜鹃的研究中表明，GA3处理后会使其内部的可溶性糖、可溶性蛋白发生不同的变化。本试验中，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3处理后的山韭种子可溶性蛋白和蛋白酶均有显著增加，这与秦祎婷等[32]用ABA对东北红豆杉(TaxuscuspidateSieb. et Zucc.)的研究结论一致。

图4 ABA和GA3处理下山韭各指标主成分分析和相关性分析Fig.4 Principal component analysis and correlation analysis of all indices of Allium senescens L. in ABA and GA3 treatment

种子在萌发过程中与其内源激素含量的变化密切相关，内源激素能够诱导贮藏物质的分解及合成并最终使种子的发芽[33]。本研究表示，100 mg·L-1ABA显著增加了山韭胚芽GA3的含量，而显著降低了胚芽ABA的含量；且100 mg·L-1GA3显著降低了山韭胚芽IAA的含量，这与袁梦佳等[34]在赤霉素浸种对柴胡(BupleurumchinenseDC.)种子的研究结论相同。ABA和GA3处理均显著增加了山韭胚芽ETH含量，GA3处理下山韭胚芽ABA和ETH含量成正比，这与黎正英等[35]的研究结果相同。发芽率与发芽势、发芽指数、活力指数、可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、脂肪酶活性之间呈正相关性，说明发芽指标与淀粉酶活性、脂肪酶活性和可溶性蛋白含量之间密切相关性，这与雍太文等[36]在外源ABA含量对杂交水稻种子萌发的研究结论一致。ABA与GA3含量之间呈负相关性，说明ABA具有拮抗GA3的作用，这与Birgit[37]和Rohde[38]等人的研究结果一致。

4 结论

综合种子发芽情况及形态指标，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3是促进山韭萌发的最佳浓度。100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3处理显著提高了发芽率、发芽势、胚芽胚根长和胚芽胚根重且均显著提高了可溶性蛋白含量、脂肪酶和蛋白酶活性。100 mg·L-1GA3处理显著提高了山韭胚芽ETH含量和ABA含量，100 mg·L-1ABA的处理显著增加了山韭胚芽GA3含量但显著降低了ABA含量。主成分分析和相关性分析表明：山韭种子发芽率、发芽指数和活力指数与可溶性蛋白、可溶性糖含量以及酶活性之间显著正相关。