HPLC法测定补中益气丸(浓缩丸)中甘草苷等5种成分的含量

孙迎春，郝自新，杨积慧，程世云，汪玉萍，刘 喜

(1 安庆市食品药品检验中心，安庆 246001；2 安徽省食品药品检验研究院；* 通讯作者,E-mail:ychsun1219@126.com)

补中益气丸(浓缩丸)是由黄芪、党参、甘草、白术、当归、升麻、柴胡、陈皮、生姜、大枣10味中药制成的浓缩丸，具有补中益气、升阳举陷的功效，由我国经典名方补中益气汤转换剂型所得。补中益气汤初次记载于《内外伤辨惑论》，是金元四大家李东垣的代表方剂之一[1]。现代实验研究表明，补中益气汤具有调节免疫、抗疲劳、抗炎、抗肿瘤等作用[2-6]，在胃肠道、心肺及肝肾等多种器官疾病的治疗上均取得满意的疗效[7-10]。中药浓缩丸从古流传至今，保留了传统汤剂的确切疗效，且具有载药量大、顺应性好、服用和携带方便、适用人群范围广等特点[11]。补中益气丸(浓缩丸)收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第7册，现行标准[12]仅收录性状描述和显微鉴别，无含量测定项，质量控制水平低，难以全面反映其内在质量，完善其质量评价体系，是当前亟需解决的问题。本研究通过建立简单、操作性强的高效液相色谱(HPLC)多波长切换法同时测定补中益气丸(浓缩丸)中甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量，从而系统、整体地为补中益气丸(浓缩丸)的质量评价提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

UltiMate3000型高效液相色谱仪(两元泵，DAD-3000型检测器，自动进样器，Chromeleon 7工作站)，赛默飞世尔科技公司；XPE105型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗机，功率500 W，昆山市超声仪器有限公司；0.45 μm微孔滤膜，比克曼生物科技有限公司。

对照品甘草苷(111610-201005，纯度94.9%)、阿魏酸(110773-201915，纯度99.4%)、异阿魏酸(111698-201904，纯度99.3%)、橙皮苷(110721-201014，纯度95.1%)、甘草酸铵(批号：110731-202021，纯度96.2%)均购于中国食品药品检定研究院；补中益气丸(浓缩丸)样品11批，市场随机采购，其中上海宝龙安庆药业有限公司3批，批号分别为210315、210313、200615；上海华源制药安徽广生药业有限公司，批号分别为210401、210402、210502；芜湖张恒春药业有限公司，批号分别为1910281、2103112；黄山市天目药业有限公司，批号分别为200601、210201、201101；各阴性样品由上海宝龙安庆药业有限公司提供；乙腈、甲醇均为色谱纯，来自美国Fisher公司，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长：0～12 min，276 nm；12～15 min，324 nm；15～25 min，283 nm；25～39 min，252 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μl。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 混合对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加70%甲醇配制成每1 ml含甘草酸铵3.828 8 mg、甘草苷0.982 2 mg、阿魏酸0.111 8 mg、异阿魏酸0.859 9 mg、橙皮苷0.841 7 mg的混合对照品储备液，分别精密量取上述对照品储备液2 ml，置同一25 ml棕色量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，室温避光保存，备用。

1.2.3 供试品溶液的制备 取补中益气丸(浓缩丸)，研细，取2.0 g，精密称定，置25 ml棕色量瓶中，加70%甲醇20 ml，超声处理45 min，放冷至室温，用70%甲醇定容，摇匀，经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性样品溶液的制备 按照补中益气丸(浓缩丸)的处方和制备工艺，分别制备缺甘草、缺当归和升麻、缺陈皮的阴性样品，按“1.2.3”项下供试品溶液的制备方法分别制备各阴性样品溶液。

2 结果

2.1 专属性试验

分别吸取“1.2.2”项下混合对照品溶液、“1.2.3”项下供试品溶液及“1.2.4”项下阴性样品溶液各5 μl，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。理论板数按各峰计算分别为：甘草苷30 026、阿魏酸44 818、异阿魏酸53 527、橙皮苷77 361、甘草酸铵49 523；5个成分分离度均大于1.5；阴性样品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱相对应保留时间处均没有干扰峰，结果见图1。

1.甘草苷(liquiritin);2.阿魏酸(ferulic acid);3.异阿魏酸(isoferulic acid);4.橙皮苷(hesperidin);5.甘草酸铵(ammonium glycyrrhizinate)

2.2 线性关系

精密量取“1.2.2”项下混合对照品贮备液0.2，0.5，1.0，3.0，5.0，10.0 ml，分别置25 ml量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，得系列浓度混合对照品溶液。取5 μl，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)，相应峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

表2 各成分线性关系

2.3 精密度试验

精密吸取“1.2.2”项下混合对照品溶液5 μl注入液相色谱仪，按“1.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为0.57%，0.32%，0.38%，0.74%，0.61%，结果表明，仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

取同一批样品(批号:210401)6份，各约2.0 g，精密称定，分别按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积并采用外标法计算出各成分的含量。甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的平均含量分别为0.968 9，0.113 2，0.853 9，0.844 8，3.755 5 mg/g，RSD分别为1.35%，0.54%，1.08%，0.83%，0.76%，结果表明本方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液(批号:210401)，分别于室温下放置0，4，8，12，16，24 h后，按“1.2.1”项下色谱条件进样，测得甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.91%，1.18%，0.55%，0.98%，0.74%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 加样回收率试验

称取已知含量的样品(批号:210401)6份，各约1.0 g，精密称定，分别置25 ml棕色量瓶中，各精密加入“1.2.2”项下混合对照品贮备液1 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法进行测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果 (n=6)

2.7 市售样品含量测定

取补中益气丸(浓缩丸)各批次，分别按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，除批号210401按重复性试验取6份外，其他各取3份，依法测定甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量并计算结果见表4。

表4 补中益气丸(浓缩丸)中5种成分含量测定结果 (mg/g)

3 讨论

3.1 提取方法的选择

试验考察了不同浓度的甲醇(100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇)和乙醇(100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇)作为提取溶剂，经比较以70%甲醇提取样品时各成分提取率均较高，且杂质干扰少。在此基础上对比浸泡过夜、超声、加热回流提取，结果显示，超声提取较加热回流提取各待测组分响应值无明显差别，且超声提取处理时间短，操作更为简便。进一步比较不同提取时间(30，45，60 min)对提取结果的影响，发现45 min时各成分可提取完全，因此，试验采用70%甲醇超声提取45 min作为补中益气丸(浓缩丸)样品的提取方法。

3.2 指标成分的选择

中药制剂具有多成分、多靶点、多通路的特点，现代研究表明，中药制剂药效的发挥主要依靠制剂内各组分的整体协同作用，单一成分的含量检测无法全面反映中药制剂的质量[13,14]。因黄芪中主要成分黄芪甲苷紫外最大吸收波长在200 nm附近，不适合紫外检测器测定含量，本课题组前期使用蒸发光散射检测器(ELSD)对黄芪甲苷含量测定方法进行了研究；按照“1.2.1”项下色谱条件，党参中主要成分党参炔苷对照品色谱峰的保留时间为19.2 min，而11批供试品溶液在对应时间均未检出，可能是党参炔苷遇热不稳定[15]，在处方制备过程中因煎煮浓缩导致含量降低而无法检出；参考相关文献[16,17]，实验前期采用5%氨水的甲醇溶液对样品进行提取，结果显示，柴胡皂苷a信号很弱，柴胡皂苷d几乎没有信号，可能与补中益气丸(浓缩丸)前处理中煎煮时间有关，柴胡在煎煮35 min(先煎煮15 min)时有效成分溶出率最高，随着煎煮时间延长，柴胡水煎液中有效成分浓度逐渐降低，因为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d属于原生皂苷，其环氧结构极不稳定，遇热易转化为柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2[18]；白术的化学成分包括挥发油、多糖、内酯类、倍半萜和苷类等，但其功效物质基础尚未明确[19]。因此，选择甘草中主要成分甘草苷和甘草酸铵、陈皮代表性成分橙皮苷、当归和升麻中共有的主要成分阿魏酸和异阿魏酸作为指标进行定量控制。

3.3 检测波长的选择

试验采用二极管阵列检测器(DAD)对补中益气丸(浓缩丸)中5种待测成分在190～400 nm波长段进行光谱扫描，发现甘草酸铵在252 nm，阿魏酸和异阿魏酸在324 nm，橙皮苷在283 nm有最大吸收；甘草苷的最大吸收波长分别为276 nm与217 nm，考虑217 nm为末端吸收，故选择276 nm作为检测波长；待测组分群各组分最大吸收差异较大。预实验阶段，筛选单一检测波长，很难使每个组分的检测响应值达到理想要求，最终采用波长切换法，0～12 min在276 nm检测甘草苷，12～15 min在324 nm检测阿魏酸和异阿魏酸，15～25 min在283 nm检测橙皮苷，25～39 min在252 nm检测甘草酸铵，实现各组分在最佳波长处被检测，提高检测灵敏度，使结果更加准确。

3.4 流动相的选择

考察4种不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液)，结果显示，有机相为乙腈，无机相中加入磷酸后，待测各组分峰形变锐，分离效果较好，但仍然有杂质峰干扰。采用梯度洗脱，比较洗脱条件，最后确定“1.2.1”项下表1中洗脱程序。在此条件下，各待测组分与相邻杂质峰均能达到有效分离，且保留时间适中。

3.5 含量分析

11批补中益气丸(浓缩丸)样品含量测定结果显示，同一厂家不同批次各成分含量较接近，但不同厂家差异明显，可能与投料和生产工艺有关，因此，补中益气丸(浓缩丸)质量的整体控制方法亟需进一步完善，以确保产品质量，从而为临床安全用药提供保障。