长链非编码RNA ATB对三阴性乳腺癌细胞的增殖、凋亡及上皮间充质转化的影响

郭晨旭，刘静波，许 睿，朱 超，张立功，钱 军*

(1 蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，蚌埠 233000；2 蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科；* 通讯作者,E-mail:qianjun215036@sina.com)

目前，乳腺癌已由女性第一大恶性肿瘤变为全球第一大恶性肿瘤，乳腺癌的治疗及预后与女性乃至全人类的健康息息相关。三阴性乳腺癌是乳腺癌中雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)以及人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表达阴性的一类分子分型，尽管治疗在过去的几十年里有所改善，但相比其他分子分型乳腺癌，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)缺少行之有效的治疗靶，从而治疗效果相对较差[1]。

研究证实，约90%以上的基因组产生的转录本为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，而长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是其中不能被编码为蛋白质的一类，长度大于200个核苷酸[2]，有研究表明lncRNAs在细胞的增殖[3]、凋亡[4]、代谢、肿瘤耐药[5]及相关的基因表达的生物学过程中扮演重要作用。位于人第14号染色体的被转化生长因子β活化长链非编码RNA(long non-coding RNA activated by transforming growth factor β，lncRNA ATB)长度约80 kb，顾名思义可由转化生长因子β激活后在调控肿瘤细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)上具有重要作用[6]，lncRNA ATB的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展有着千丝万缕的关联[7-9]。而现阶段关于lncRNA ATB与TNBC生物学特性关系的报道较少，本文旨在集中探讨lncRNA ATB在TNBC细胞MDA-MB-231的发展过程中对增殖、凋亡、侵袭迁移的影响，进而探讨lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞EMT的作用，阐述lncRNA ATB对TNBC生物学特性的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺上皮细胞MCF-10A及人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院武汉细胞库；BCA蛋白浓度试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；马血清购自德宁生物技术有限公司；DMEM/F12、1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭科技股份有限公司；Lipofectamine RNAiMAX试剂盒购自美国赛默飞氏尔科技公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司；E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)单克隆一抗及HRP(辣根过氧化物酶)抗鼠抗体(1∶3 000)购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌临床组织标本选取 随机选取2020年1月至2020年12月在蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科行手术治疗的TNBC患者组织标本18例，术前患者未行新辅助治疗，经本院病理科病理学确诊及免疫组化明确为TNBC，标本中配对选取癌组织(Tumor)及距癌组织5 cm左右的癌旁组织(Normal)。研究经蚌埠医学院第一附属医院医学伦理委员会伦理批准(伦科批字[2021]第165号)，患者均签署知情同意。

1.2.2 细胞培养与细胞转染 MCF-10A细胞培养于5%马血清、10 μg/ml胰岛素、20 ng/ml EGF、5 μg/ml氢化可的松的DMEM/F12完全培养基，MDA-MB-231培养于10%胎牛血清的1640完全培养基，培养条件为37 ℃，5%CO2。

细胞在10 cm培养皿中培养，应用Lipofectamine2000在细胞增长至50%～60%时对细胞进行阴性小干扰RNA(siRNA，si-NC组)和lncRNA ATB小干扰RNA(si-ATB组)的转染。在确认转染效率后可在48 h后提取RNA和总蛋白进行qRT-PCT及Western blot检测。

1.2.3 CCK-8法检测si-ATB对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响 收集细胞悬液，调整细胞浓度后96孔板中每孔添加5×103细胞，分为si-NC组和si-ATB组，每组12孔，每时间段3孔以及额外1孔相同容积不含细胞的细胞培养液为空白对照，普通培养(第2天常规换液)，分别在21，45，69，93 h时加入CCK-8试剂20 μl，酶标仪分别检测加入CCK-8试剂3 h后即24，48，72，96 h在450 nm处吸光度。增殖细胞活力计算公式为：(ODsi-ATB-OD空白)/(ODsi-NC-OD空白)×100%。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测lncRNA ATB的表达 先提取总RNA，TRIzol试剂提取后将1 μg的总RNA实施逆转录PCR，反应条件为95 ℃先进行5 min的预变性，相同温度10 s变性，55 ℃退火温度进行45个扩增循环，选取GAPDH作为内参。2-ΔΔCt表示lncRNA ATB的表达量。lncRNA ATB的引物序列如下，上游：5′-CACTTCATGAAGTTCACTC-3′，下游:5′-TAAGCCGTCATAGAGATCT-3′。GAPDH的引物序列如下，上游:5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTC-3′,下游:5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。

1.2.5 流式细胞仪检测下调lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞凋亡能力的影响 两组细胞分别接种至6孔细胞培养板，常规培养24 h后收集细胞，调整适当的细胞浓度以取105个细胞，4 μl PI和2 μl Annexin Ⅴ-FITC加入200 μl Binding Buffer重悬的细胞，直接室温孵育15 min，需避光处理。最后上机检测细胞的凋亡率。

1.2.6 细胞划痕实验检测下调lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 6孔细胞培养板分别接种两组细胞，在细胞融合至约90%划痕时使用200 μl移液枪头进行划痕，PBS冲洗3次后加入1%胎牛血清培养基，0 h和24 h时观察细胞的迁移情况。细胞迁移率计算公式：迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.7 Transwell检测下调lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响 先预处理8 μm Transwell小室，以培养基按8∶1的比例稀释基质胶，此培养基内无血清，每室的上室中加入25 μl稀释后的基质胶后置细胞培养箱内孵育1 h。siRNA转染后48 h制作两组细胞悬液，PBS清洗两次，调整细胞浓度，上室加入5×104个细胞(200 μl)，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培养基。细胞培养箱常规培养24 h后PBS清洗3次后加结晶紫染色，棉签擦拭未迁移的细胞，倒置显微镜观察侵袭细胞计数。

1.2.8 Western blot检测下调lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白表达量的影响 5 ml EP管收集两组细胞，冰上操作以RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测试调整蛋白浓度，50 μg蛋白上样电泳，将蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后孵育一抗过夜，其中一抗稀释比例为E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)。而后使用TBST洗膜3次，继续HRP二抗(稀释比例1∶3 000)孵育30 min后ECL系统可视化，灰度值利用凝胶成像系统分析。选择GAPDH作为内参，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 lncRNA ATB在TNBC组织及MDA-MB-231细胞中的表达情况

qRT-PCR结果显示在TNBC组织中lncRNA ATB的表达明显高于癌旁组织(P<0.05，见图1)。同时在TNBC细胞MDA-MB-231中lncRNA ATB的表达也要明显高于人乳腺上皮MCF-10A细胞(P<0.05，见图1)。

与Normal比较，* P <0.05；与MCF-10A比较，* P <0.05

2.2 CCK-8检测lncRNA ATB对TNBC增殖的影响

siRNA沉默MDA-MB-231细胞的lncRNA ATB，qRT-PCR检测沉默效率，相比si-NC组，si-ATB组lncRNA表达下调明显(P<0.05，见图2)。而CCK-8法检测沉默后MDA-MB-231细胞增殖能力，发现相比si-NC组而言，si-ATB组的MDA-MB-231细胞增殖能力及细胞存活率在48，72，96 h处明显降低(P<0.05，见图2)。

与si-NC相比较，* P <0.05

2.3 流式细胞仪检测沉默lncRNA ATB后MDA-MB-231细胞的凋亡水平

相比si-NC组，si-ATB组细胞凋亡率显升高(12.24% ±1.52%vs24.33% ±2.15%，P<0.05，见图3)。

与si-NC相比较，* P <0.05

2.4 细胞划痕实验、Transwell检测lncRNA ATB对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响

在24 h时观察细胞划痕实验，相比si-NC组，si-ATB组细胞迁移率明显减弱(61.0% ±5.0%vs31.7% ±3.3%，P<0.05，见图4)。与此同时，Transwell实验结果显示相比si-NC组，si-ATB组细胞的侵袭能力明显减弱(40.33 ±3.51vs15.67 ±2.52，P<0.05，见图4)。

与si-NC相比，* P <0.05

与si-NC相比，* P <0.05

2.5 Western blot检测转染后MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白的表达

与si-NC组相比，si-ATB组细胞的EMT相关蛋白的表达出现明显变化，其中si-ATB组E-cadherin蛋白表达相比si-NC组明显增强(0.63 ±0.05vs0.42 ±0.04，P<0.05，见图6)。si-ATB组vimentin蛋白表达相比si-NC组明显减弱(0.32 ±0.04vs0.55 ±0.05，P<0.05，见图6)。si-ATB组N-cadherin蛋白表达相比si-NC组明显减弱(0.38 ±0.04vs0.62 ±0.06，P<0.05，见图6)。

与si-NC相比较，* P <0.05

3 讨论

乳腺癌是危害女性健康最大的杀手之一，近年来已有很多学者证实了lncRNAs在乳腺癌发生发展中起到重要作用[10-12]，其在乳腺癌细胞的增殖、迁移、耐药等过程中均扮演重要的角色。lncRNAs具有高度的细胞类型特异性和多种生物学功能，有望能够成为乳腺癌的新分子靶点。现阶段为验证lncRNAs的功能，通常可以使用RNA干扰、反义寡核苷酸、小分子抑制剂来靶向下调lncRNAs的表达，进而检测表观遗传学的改变。众所周知，乳腺癌分为4种分子亚型，这种异质性和复杂性恰恰是某些乳腺癌患者预后不佳的关键原因，一些lncRNAs在多种非TNBC细胞中异常表达，能够通过ceRNA作用激活相关的信号传导通路来发挥生物学功能，目前已有研究显示在管腔亚型转移性乳腺癌中，干扰lncRNA MALAT1的表达可以显著防止肿瘤的转移和增殖[13]。又例如HOTAIR[14]、lincROR[15]、BCAR4[16]，这些lncRNAs的过表达能够促进其他非TNBC细胞的侵袭和转移。研究表明这其中的机制可能在从转录到翻译的不同水平上均有调节和功能，同时也可调控诸如TGF-β、NK-κB、STAT3等信号通路来影响肿瘤细胞的侵袭和转移。与此同时，与促进转移的lncRNAs相比，也有一部分是参与抑制乳腺癌转移的，例如NKILA[17]、ANCR[18]等，这些lncRNAs的下调促进了乳腺癌的迁移、侵袭和转移。越来越多的证据的表明lncRNAs可能成为乳腺癌转移的一个有前途的生物标记物。

综合以上，使用lncRNAs作为乳腺癌治疗的主要靶点，已经引起了广泛的研究关注。而目前在临床治疗上TNBC因其缺少相对应的靶向治疗的目标而尤为难治，所以目前从分子靶向层面寻找TNBC的治疗策略显得尤为重要。故以此为突破口，我们试图寻求治疗TNBC的可能的潜在靶点。

首先，我们在TNBC的癌组织中发现lncRNA ATB的表达量明显高于癌旁组织，说明lncRNA ATB的表达可能参与了TNBC的发生发展。进而我们通过选择相应的TNBC的细胞系MDA-MB-231进行细胞的转染，在调低lncRNA ATB后观察各细胞表型的改变。结果我们发现下调MDA-MB-231细胞中lncRNA ATB的表达后，CCK-8实验显示si-ATB组的细胞增殖能力明显低于si-NC组，这表明下调lncRNA ATB的表达后能够抑制MDA-MB-231的增殖。进一步，本研究通过流式细胞仪技术发现si-ATB组的细胞凋亡率明显高于si-NC组，这说明细胞增殖的不足可能由于细胞的凋亡增多引起。

其次，我们在说明了lncRNA ATB抑制MDA-MB-231细胞增殖且促进其凋亡的同时，也探讨了lncRNA ATB是否能对MDA-MB-231细胞的侵袭转移能力有所影响。划痕实验和Transwell结果显示在lncRNA ATB被下调后MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显下降。那么我们继续应用Western blot技术检测细胞转染后的EMT相关蛋白的表达，众所周知，发生了EMT的细胞尤其是恶性肿瘤细胞的特征性表型蛋白E-cadherin蛋白是下降的，而vimentin蛋白和N-cadherin蛋白是升高的，这会引起细胞黏附能力的减弱，进而细胞有更强的活动性，发生更强的迁移和转移[19]。而Western blot结果显示相比si-NC组而言，si-ATB组细胞中E-cadherin蛋白表达发生了上升而vimentin蛋白、N-cadherin蛋白的表达发生了下降，这同EMT的发生过程是相反的。因此从蛋白机制层面，我们认为调低lncRNA ATB影响TNBC生物学特性的其中一个机制可能是逆转了细胞的上皮间充质转化。

最后，我们得出结论，lncRNA ATB可能成为评估乳腺癌预后的指标，从机制层面说明lncRNA ATB的过表达可能会使得TNBC患者具有高度的复发转移的风险。而在细胞的层面上调低lncRNA ATB的表达能够增加TNBC细胞的凋亡进而减弱其增殖能力。与此同时调低lncRNA ATB可能会参与TNBC细胞EMT的逆转过程，继而来减弱TNBC细胞的迁移、侵袭的能力，从而可能减弱TNBC远处转移的风险。