高糖状态下牙龈成纤维细胞生物学行为改变的体外研究

刘艳艳,李振强,高林琳,任 伟,张 楠*

(1 山西白求恩医院，同济山西医院，山西医科大学第三医院口腔科，太原 030032；2 山西白求恩医院,同济山西医院,山西医科大学第三医院内分泌科；* 通讯作者,E-mail:zhangnan19770718@sina.com)

牙龈软组织细胞良好的增殖和分泌功能是种植术后初期愈合和种植修复长期稳定的必要条件之一[1]。种植体-牙龈软组织界面是防止口内各种生物因素和理化因素破坏内环境的生物屏障，该屏障主要是由结合上皮和牙龈结缔组织附着种植体表面而形成[2]。人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGFs)是牙龈结缔组织中主要的间质细胞，其参与牙周组织的形成和再生，维持牙周组织的功能和完整性[3]。HGFs具有合成和分泌细胞外基质的重要功能，其分泌的Ⅰ型胶原蛋白(type Ⅰ collagen, COL1)、Ⅲ型胶原蛋白(type Ⅲ collagen, COL3)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)是牙龈软组织附着钛种植体表面的重要黏附蛋白[1,2]。

糖尿病是种植修复成功的风险因素之一，糖尿病不仅影响种植体骨整合，且影响种植体颈部软组织结合。笔者前期研究观察到，随着葡萄糖浓度的增加，HGFs在纯钛表面的附着和增殖能力减弱[4]。为进一步探究高糖状态影响HGFs在纯钛表面附着和增殖的病理机制，本研究拟在高糖条件下体外培养HGFs，应用噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium, MTT)比色分析法检测HGFs的增殖能力变化，应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定HGFs分泌COL1、COL3和FN的功能变化。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

人牙龈成纤维细胞株(CRL-1446 H9c2 ATCC，上海佳和生物技术有限公司)，MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)，Ⅰ型人类胶原蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(E-EL-H0130c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，Ⅲ型人类胶原蛋白ELISA试剂盒(E-EL-H0774c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，人纤维连接蛋白ELISA试剂盒(E-EL-H0179c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 培养基制备

将左旋葡萄糖添加入DMEM培养基[4]，分别制备葡萄糖浓度为5.5，7，8.8，10，15，20 mmol/L的细胞培养基。

1.3 细胞培养

HGFs细胞株(CRL-1446 H9c2 ATCC)购自上海佳和生物技术有限公司。将细胞传代培养至第5代，将其制备成4.0×104个/ml细胞悬液，取等量细胞悬液接种于各组细胞培养基，每个浓度设立10个复孔，每培养48 h换液一次。

1.4 MTT试验检测细胞增殖状况

接种培养1，3，7 d后，分别将6组细胞悬液置于96孔板(100 ml/孔)中，每孔加入10 μl无菌MTT(5 mg/ml)，37 ℃、5% CO2环境下再孵育4 h后，吸弃上清，在每口孔中加入150 μl的二甲基亚砜，室温低速振荡10 min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪检测568 nm波长处的吸光度(A值)，并计算各组平均A值(A值与细胞增殖能力呈正比)。

1.5 HGFs增殖形态观察

接种培养1，3，7 d时，取各组细胞悬液置于倒置显微镜下，每组选取3个视野(×100)观察细胞形态并拍照。

1.6 ELISA试验检测COL1、COL3、FN分泌量

接种培养3，7 d时，取各组细胞悬液，吸弃上清，分别使用Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和人纤维连接蛋白ELISA试剂盒，将标的物放入酶联免疫反应板，按照使用说明步骤，依次加入生物素化抗体、HRP Conjugate工作溶液、底物溶液及终止溶液，终止反应后溶液由蓝色变为黄色，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)，测定不同培养时间各组细胞分泌的COL1、COL3、FN的表达量。

1.7 统计学分析

使用SPSS13.0软件包对各组A值和OD值进行进行单因素方差分析，两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 高糖状态对HGFs形态的影响

接种培养1，3，7 d，在葡萄糖浓度<10 mmol/L各组，HGFs形态均规则，呈长梭形或多角形，可见较长的细胞突起，胞浆突2～4个，胞核呈圆形，镜下视野密度较大，排列呈束状或漩涡状，且随着培养时间的增加，同一浓度组镜下细胞密度逐渐增大；而葡萄糖浓度≥10 mmol/L各组，镜下视野密度均比低浓度组减小，细胞形态较不规则，呈现异型性，排列不规律，且随着培养时间的增加，同一浓度组细胞密度无显著改变，培养7 d还可观察到部分细胞胞浆突起变短甚至消失不见(见图1-3)。

图1 不同葡萄糖浓度培养1 d HGFs增殖形态变化 (×100)Figure 1 Changes of proliferation of HGFs cultured with different concentrations of glucose for 1 d (×100)

2.2 高糖状态对HGFs增殖能力的影响

MTT检测结果显示在接种培养1 d时，葡萄糖浓度5.5，7，8.8 mmol/L各组，A值变化没有明显差异，HGFs增殖量变化差异无统计学意义P>0.05)；葡萄糖浓度10，15，20 mmol/L各组，随着葡萄糖浓度的增高，A值均显著减小，HGFs增殖能力明显降低，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。在培养3，7 d时，不同葡萄糖浓度培养HGFs增殖量变化趋势与1 d一致(见表1)。

图2 不同葡萄糖浓度培养3 d HGFs增殖形态变化 (×100)Figure 2 Changes of proliferation of HGFs cultured with different concentrations of glucose for 3 d (×100)

图3 不同葡萄糖浓度培养7 d HGFs增殖形态变化 (×100)Figure 3 Changes of proliferation of HGFs cultured with different concentrations of glucose for 7 d (×100)

表1 不同葡萄糖浓度不同培养时间人牙龈成纤维细胞增殖的变化

2.3 高糖状态对HGFs分泌功能的影响

ELISA试验结果显示在接种培养3，7 d时，HGFs分泌COL1、COL3以及FN的变化趋势相似，均随着葡萄糖浓度的升高，分泌量呈现减少趋势(见图4，5)。

HGFs培养3 d时，在葡萄糖浓度5.5,7,8.8 mmol/L各组，COL1、COL3和FN分泌量变化的差异均无统计学意义(P>0.05)；与5.5，7，8.8 mmol/L组相比，10，15，20 mmol/L组COL3、FN分泌量均显著减少，且随葡萄糖浓度的升高而减少，两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)；而葡萄糖浓度15,20 mmol/L组，COL1的分泌量显著减少，两两比较差异具有统计学意义(P<0.05，见图4)。

与5.5，7，8.8 mmol/L组相比，* P <0.05；与10 mmol/L组相比，#P <0.05；与15 mmol/L组相比，& P <0.05

HGFs培养7 d时，在葡萄糖浓度5.5，7，8.8 mmol/L各组，COL1、COL3和FN分泌量变化的差异均无统计学意义(P>0.05)；与5.5，7，8.8 mmol/L组相比，10，15，20 mmol/L各组COL1、COL3、FN的分泌量显著减少，且随葡萄糖浓度的升高而减少，两两比较差异具有统计学意义(P<0.05，见图5)。

与5.5，7，8.8 mmol/L组相比，* P <0.05；与10 mmol/L组相比，#P <0.05；与15 mmol/L组相比，& P <0.05

3 讨论

目前，我国糖尿病患病率为28.8%～31.8%，糖尿病患者数量居世界首位，因糖尿病-牙周炎导致的牙齿缺失病例日常临床中较为常见[5]。种植义齿是牙齿缺失患者主要的修复方法之一，其在生物学、生物力学和美学方面与天然牙高度仿生[6]。种植义齿的近远期修复效果不仅依赖良好的骨整合，种植体颈部良好的软组织封闭也发挥着重要作用[7]。功能良好的牙龈组织是种植体防御口腔各种损伤因素的第一道生物屏障,糖尿病患者种植术前适应证的准确选择和种植后血糖有效控制对维持这一防御机制具有重要意义[8]。David等[8]学者的临床队列研究结果显示高糖状态与种植体周组织破坏存在关联，但尚缺乏关于高糖状态对纯钛表面附着人牙龈软组织细胞影响的实验室研究报道。笔者的前期研究观察到HGFs在纯钛试件表面的附着数量和增殖能力随细胞培养基的葡萄糖浓度的升高而降低[4]。为了阐明前期研究观察结果的病理机制，本研究结合临床糖尿病诊断标准和外科手术适应证关于血糖值要求，增加了葡萄糖浓度分组和体外培养HGFs的时间。本研究MTT法测定结果发现，在不同培养阶段当葡萄糖浓度高于8.8 mmol/L时，HGFs增殖数量均表现为减少趋势，同时细胞形态逐渐呈现衰老征象。

COL1、COL3和FN是HGFs分泌的重要细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)，对HGFs的迁移和黏附有着促进作用，HGFs附着于钛种植体表面是以ECM为介导，在种植术后通过黏着斑连接方式使牙龈组织黏附于纯钛表面，因此，ECM的数量和功能在术后牙龈愈合过程和上部结构修复后种植周围牙龈组织健康的维持起重要作用[9-11]。Jesse等[12]在体外模拟糖尿病患者的体内环境改变，使COL1和FN快速被糖化，随着细胞培养基内COL1和FN的量减少，同时糖化COL1(glycated COL1)和糖化FN(glycated COL1)的量增加，牙周韧带成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLs)和HGFs的细胞尺寸、形态和细胞迁移、黏附能力均有显著不良改变，继而推断高糖状态下ECM数量减少和功能降低是影响牙周组织伤口愈合的主要因素之一。Steffensen等[13]的研究结果也显示牙周组织伤口愈合有赖于增殖能力良好的PDLs和ECM大分子的协调作用。本研究使用高糖细胞培养基培养HGFs 1 d后，未检测出ECM蛋白表达，因此未在文中讨论；培养3天和7天后，可检测出ECM蛋白表达，当葡萄糖浓度高于8.8 mmol/L时，HGFs细胞形态发生不良改变，细胞增殖数量显著减少，COL1、COL3和FN 3种ECM的分泌量亦显著降低，以此推测前期研究中高糖状态下HGFs附着纯钛表面数量的减少与ECM的表达改变有关。

上述研究结果对后续进一步研究AGEs对HGFs的影响具有一定参考意义。AGEs作为晚期糖基化终末产物，Fu等[14]通过免疫组化实验证明细胞内AGEs通过3种机制损伤牙周细胞：①AGEs前体修饰细胞内蛋白功能；②AGEs前体与其他基质成分和细胞外基质受体相互作用，从而改变细胞外基质成分；③AGEs前体与内皮细胞、系膜细胞和巨噬细胞中的RAGE结合改变血浆蛋白，继而诱导炎症因子的产生。同时有学者对与AGEs在结构、功能和生物学效应方面具有某些相似性的晚期蛋白氧化产物进行了研究，晚期蛋白氧化产物(advanced oxidative protein products，AOPP)是在氧化应激过程中，体内蛋白被氧化所生成的稳定产物的总称，其能抑制成纤维细胞增殖，该抑制作用可能不是通过诱导细胞凋亡来实现，而是增加了金属基质蛋白酶1的合成，从而促进胶原溶解，加速牙周病进程[15]。

本研究由于实验技术条件所限，未对糖化COL和糖化FN进行检测和讨论，后续研究将着重探讨糖基化终产物(AGEs)对附着纯钛表面HGFs生物学行为的影响。