TRIM59对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡及EMT的影响

罗燕贞，刘 翔，王文忠

(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，蚌埠 233004；

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，具有很高的转移潜能，75%患者可发生颈部淋巴结转移[1]。目前在临床上NPC治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移[2]，因此早期诊断和治疗对鼻咽癌的预后具有至关重要作用。但目前对于鼻咽癌的发病及转移机制尚不明确，所以阐明鼻咽癌的发病和转移机制可为鼻咽癌的治疗提供更坚实的理论依据。

三基序蛋白59(tripartite motif containing 59，TRIM59)是三结构域蛋白(tripatite motif containing，TRIM)家族的主要成员之一[3]。TRIM59位于人类三号染色体上，编码翻译的蛋白质共403个氨基酸，属于TRIM家族C-XI亚型之一[4]。越来越多实验证明，TRIM59在肿瘤组织中表达量上升，与肿瘤细胞的增殖、凋亡及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关[5]，且与肿瘤临床分期及预后紧密相关[6]。目前，对TRIM59的研究主要集中在免疫应答和肿瘤研究[7]。已有研究证明，TRIM59与食管癌[8]、肺癌[9,10]、卵巢癌[11,12]、胰腺癌[13]、黑色素瘤[14]、乳腺癌[15]、胶质母细胞瘤[16]等有关，但目前对于TRIM59与鼻咽癌的关系尚不明确。本研究意在探究TRIM59对鼻咽癌的增殖、凋亡及EMT的影响，从而为鼻咽癌在临床治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人正常鼻黏膜上皮细胞系(HNEpC)和人鼻咽癌细胞系HNE1和CNE-2Z均购自中国科学院上海细胞研究所。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶(含EDTA)购自美国Gibco公司。胎牛血清(FBS)、Materigel胶购自浙江天杭生物科技股份有限公司。CCK-8试剂盒、双染细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinⅤ-FITC/PI)、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天公司。TRIM59抑制物(si-TRIM59)、TRIM59模拟物(mimic-TRIM59)及Lipofectamin2000购自上海吉玛基因。一抗(TRIM59、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax)及二抗均购自美国Affinity Biosciences公司。

1.2 细胞培养

人正常鼻黏膜上皮细胞系(HNEpC)和鼻咽癌细胞系HNE1和CNE-2Z培养在含有10%FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中，将细胞放置在37 ℃恒温及5%CO2的培养箱中培养。

1.3 细胞转染

将HNE1和CNE-2Z细胞接分别种于6孔板中，细胞密度为3×105/孔，待细胞融合度达到60%时按照说明书使用Lipofectamin2000对细胞中的TRIM59进行下调或上调。在下调TRIM59时，分别转染si-NC、si-TRIM59-1、si-TRIM59-2、si-TRIM59-3，选择敲低效率最明显质粒构建si-TRIM59组。在上调TRIM59时，分别转染mimic-NC、mimic-TRIM59，验证转染效率，选择mimic-TRIM59构建TRIM59-mimics组。在后续实验中将进行如下分组：si-NC组(Lip2000+si-NC)、si-TRIM59组(Lip2000+si-TRIM59)及mimic-NC组(Lip2000+mimic-NC)、TRIM59-mimics组(Lip2000+mimic-TRIM59)。转染后在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养6 h，换成含有10% FBS的RPMI-1640培养基继续培养。后续实验皆在此基础上进行。

1.4 CCK-8实验检测细胞增殖

通过CCK-8实验检测下调或上调TRIM59对细胞增殖的影响。将转染后细胞重新消化、计数后接种于96孔板中，调整每孔培养液为100 μl，细胞密度为5×103/孔，放入37 ℃细胞培养箱分别培养24，48，72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37 ℃细胞培养箱孵育1 h后在酶标仪上选择450 nm波长测定吸光度。

1.5 集落形成实验检测细胞增殖

为了探究TRIM59上调或下调对鼻咽癌细胞增殖的影响进行了集落形成实验。将转染后细胞常规消化离心收集细胞沉淀，重悬细胞沉淀，调整细胞浓度，以1×103/孔将细胞接种于6孔板中，放入细胞培养箱中培养2周后，弃培养液，用PBS洗涤，甲醇固定，结晶紫染色，拍照。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

为了探讨下调或上调TRIM59对鼻咽癌细胞迁移的影响，进行了细胞划痕实验。将转染后细胞接种于6孔板于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合率达到90%时用无菌枪头于细胞表面划过，用PBS洗涤去除细胞碎片，加入无血清培养液进行培养，分别在0，48 h同一视野拍照。细胞迁移率计算方法：迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

通过Transwell分析TRIM59上调或下调后对细胞迁移、侵袭的影响。迁移实验：将转染后细胞常规消化离心收集细胞沉淀，无血清培养基重悬，以2×104/孔的密度置于Transwell小室的上室中，将含有10%FBS的完全培养基置于下室，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后取出小室，将其固定、染色后于倒置显微镜镜下随机选取3个视野进行计数，取平均值。

侵袭实验：在Transwell小室的上室底部预先每孔铺50 μl的Matrigel胶，于37 ℃培养箱中凝固1 h。将转染后细胞常规消化离心收集细胞沉淀，无血清培养基重悬，以2×104/孔的密度置于Transwell小室的上室中，将含有10%FBS的完全培养基置于下室，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后取出小室，固定、染色，于倒置显微镜下随机选取3个视野进行计数，取平均值。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

通过流式细胞术检测了TRIM59下调或上调对鼻咽癌细胞凋亡的影响。将转染后细胞用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 000g离心10 min，用PBS洗涤两次，分别加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液混匀，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液轻轻混匀，避光冰浴15 min;加入10 μl PI,避光冰浴5 min，加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液混匀。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 Western blot法检测TRIM59、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

通过Western blot法首先检测在HNEpC、HNE1及CNE-2Z中TRIM59蛋白表达情况。其次检测si-NC组、si-TRIM59组及mimic-NC组、TRIM59-mimics组细胞中与EMT、凋亡相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax表达情况。

将细胞用细胞刷刮下，收集细胞沉淀，用RIPA裂解缓冲液充分裂解后提取其总蛋白，所提取的蛋白质通过BCA法检测其浓度，计算出每组蛋白所需的蛋白量，每组取等量蛋白进行SDS PAGE凝胶上样，电泳分离蛋白质，并转印到PVDF膜，快速封闭液封闭蛋白条带30 min。一抗TRIM59、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax按1∶1 000比例稀释，将所得蛋白条带放于上述稀释后的一抗中，于4 ℃冰箱中静置一夜，二抗中孵育2 h，ECL发光试剂盒曝光显影。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 TRIM59在人鼻咽癌细胞中上调

Western blot结果显示，与人正常鼻黏膜上皮细胞系(HNEpC)相比，鼻咽癌细胞系HNE1和CNE-2Z中TRIM59的蛋白表达量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与HNEpC相比，* P <0.05

2.2 TRIM59对鼻咽癌细胞增殖的影响

Western blot结果表明，与si-NC相比，转染si-TRIM59后，HNE1和CNE-2Z细胞中TRIM59的蛋白表达水平明显降低,其中以si-TRIM59-3的转染效率最高，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)，因此在后续实验中选择si-TRIM59-3进行si-TRIM59构建；与转染mimic-NC相比，转染mimic-TRIM59后，HNE1和CNE-2Z细胞中TRIM59的蛋白表达水平明显上调(P<0.05,见图2)，在后续实验中选择mimic-TRIM59进行TRIM59-mimics构建。

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05

CCK-8实验结果显示，与si-NC相比，si-TRIM59组的细胞增殖受到抑制；与mimic-NC相比，TRIM59-mimics组的细胞增殖则升高(P<0.05,见图3)。细胞克隆实验结果显示，TRIM59下调后细胞形成的集落数量减少，而TRIM59上调后细胞形成的集落数量增加(P<0.05，见图4)。上述结果证实下调TRIM59后抑制鼻咽癌细胞的增殖，而上调TRIM59后促进鼻咽癌细胞的增殖。

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05

2.3 TRIM59对鼻咽癌细胞凋亡的影响

流式细胞术实验结果显示，与si-NC组相比，si-TRIM59组的细胞凋亡率增加；与mimic-NC相比，TRIM59-mimics组细胞的凋亡率下降(P<0.05，见图5)。此外，通过Western blot实验，我们发现与si-NC组相比，si-TRIM59组中Bcl-2表达量下降，Bax表达量上升；而与mimic-NC组相比，TRIM59-mimics组的结果则相反(P<0.05，见图6)。上述结果表明，下调TRIM59可促进鼻咽癌细胞的凋亡，而上调TRIM59则抑制鼻咽癌细胞的凋亡。

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05C.统计学分析细胞凋亡率

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05

2.4 TRIM59对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响

细胞划痕实验结果显示，si-TRIM59组细胞迁移能力较si-NC组低,而TRIM59-mimics组细胞迁移能力较mimic-NC组高(P<0.05，见图7)。在Transwell迁移实验中，与si-NC组相比，si-TRIM59组细胞迁移数量明显下降；与mimic-NC组相比，TRIM59-mimics组细胞迁移数量明显上升(P<0.05，见图8)。在Transwell侵袭实验中，与si-NC组细胞相比，si-TRIM59组细胞侵袭的数量明显减少；而与mimic-NC组相比，TRIM59-mimics组细胞侵袭的数量明显上升(P<0.05，见图9)。上述结果显示下调TRIM59抑制鼻咽癌细胞的迁移、侵袭，而上调TRIM59则促进鼻咽癌细胞的迁移、侵袭。

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05

与si-NC组相比，* P <0.05；与mimic-NC相比，# P <0.05

2.5 TRIM59对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响

Western blot结果表明，与si-NC组相比，si-TRIM59组E-cadherin的蛋白表达上升，N-cadherin和Vimentin的蛋白表达下降(P<0.05，见图10)。与mimic-NC组相比，TRIM59-mimics组E-cadherin的蛋白表达下降，N-cadherin和Vimentin的蛋白表达上升(P<0.05，见图11)。上述结果提示TRIM59可以通过影响E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白来调节鼻咽癌细胞的EMT过程。

与si-NC组相比，* P <0.05

与mimic-NC相比，# P <0.05

3 讨论

NPC是鼻咽黏膜的恶性上皮肿瘤，在中国南方和东南亚地区发病率高，具有明显的种族和地域分布[17]。目前，放疗联合化疗虽然提高了患者的生存率，但疗效差和总生存率较低仍是关键问题，NPC患者在晚期出现局部复发和远处转移是其治疗失败的主要原因[18]。因此，探寻鼻咽癌的发生和转移机制对于寻找临床的治疗方案有着重要意义。

TRIM家族涉及许多关键过程，包括免疫[19]、转录调节[20]、神经发育[21]、细胞分化[22]和癌症[23,24]等，而TRIM59是TRIM家族的一员，已有相关实验证实，TRIM59可作为一种新的多肿瘤标记物用于免疫组织化学检测早期肿瘤发生，并可指导肿瘤分子靶向诊断和治疗，如TRIM59在肝细胞癌中过表达，且促进肝癌细胞的增殖和迁移[25]。因此，对TRIM59在鼻咽癌的发生发展中发挥的作用及其机制研究可能为鼻咽癌的治疗提供有效的靶点，然而，TRIM59对鼻咽癌之间的内在调控关系尚未明确。在本实验中，首先通过Western blot验证TRIM59蛋白表达水平在鼻咽癌细胞中高于正常鼻黏膜细胞。其次,在查询相关网站后构建敲低或过表达载体，因过表达载体是直接将目的基因编码区构建到相应的质粒中，不易出现脱靶效应，因此只构建了1组过表达质粒，选择mimic-TRIM59进行TRIM59-mimics组构建，而在构建敲低组质粒时，为防止脱靶效应，分别选择从3个不同基因序列进行敲低，通过Western blot验证转染效率，选择敲低效率最高的si-TRIM59-3构建si-TRIM59组。通过CCK-8和细胞克隆实验验证，下调TRIM59使细胞增殖能力明显受到抑制，而上调TRIM59则促进细胞增殖；流式细胞术实验结果显示，下调TRIM59可以促进鼻咽癌细胞凋亡，上调TRIM59可以抑制鼻咽癌细胞凋亡；而且Western blot结果表明，在下调TRIM59后，抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2表达量下降，促进细胞凋亡的蛋白Bax表达量上升，而上调TRIM59后，Bcl-2表达量上升，Bax表达量下降。上述实验结果提示TRIM59可以促进鼻咽癌细胞的增殖，抑制其凋亡。

EMT是指静止的上皮细胞向间质细胞的转分化过程，是一种可逆转的细胞程序，越来越多实验证实，EMT与肿瘤的转移过程相关[26]，如γ-氨基丁酸A型受体相关蛋白(GABARAP)可以通过AKT/mTOR信号通路抑制乳腺癌的EMT过程[27]。为了研究TRIM59在鼻咽癌细胞中是否与EMT相关。首先，本研究进行Transwell和细胞划痕实验，与si-NC组相比，si-TRIM59组迁移和侵袭的能力明显下降，而与mimic-NC组相比，TRIM59-mimics组迁移和侵袭的能力明显上升。其次，通过Western blot研究了下调或上调TRIM59后鼻咽癌细胞内EMT相关蛋白的表达情况。实验结果表明，下调TRIM59后会导致E-cadherin表达上升，N-cadherin和Vimentin表达下降，而TRIM59过度表达则会导致E-cadherin下降，N-cadherin和Vimentin上升，这表明下调TRIM59可以抑制鼻咽癌细胞的EMT过程，而上调TRIM59则可以促进鼻咽癌细胞的EMT过程。

综上所述，本研究结果表明TRIM59在鼻咽癌细胞中高表达，而且下调TRIM59后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖和EMT进程，促进凋亡，而上调TRIM59后则可以促进鼻咽癌细胞的增殖及EMT进程，抑制凋亡，这提示TRIM59可以作为鼻咽癌临床治疗的一个潜在的靶点。但在本实验中未能收集临床病理组织和进行相应的动物实验，同时未能进一步阐明TRIM59是通过何种具体分子机制影响EMT进展，在后续实验中将进一步完善以上不足之处，从而进一步证实TRIM59可作为鼻咽癌的治疗靶标。