纤维素酶和木聚糖酶协同发酵葡萄籽为主的混合饲料的条件优化

■高慧娟 段平平 王 彦 吴 巧 张洋洋 朱国鑫 李晓卓 许贵善，2*

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

葡萄酒厂将新鲜葡萄榨汁后产生大量的葡萄渣，而这些副产物一般不做任何加工，堆积发酵后作为肥料，甚至当作垃圾处理[1-3]。这不仅容易滋生病菌，还会造成水源、土壤资源的污染，更是饲料资源的极大浪费。而葡萄籽是经分离葡萄皮、葡萄梗处理后所得产物。相对于普通的粗饲料而言，葡萄籽中富含氨基酸、蛋白质、维生素及各种矿物质等营养物质[4-5]，以及酚类物质、脂肪、膳食纤维和酒石酸等可利用成分[6]，在动物营养、抗氧化和免疫方面有极大的利用价值[7-8]。研究表明，将葡萄籽作为草食动物饲料应用，不仅可以改善动物机体抗氧化和免疫机能，提高动物生产性能和畜产品品质[9]，而且还可以节约常规饲料资源，降低饲养成本，缓解我国优质粗饲料资源紧缺的压力[10]。

葡萄籽中含有较多粗纤维，纤维物质能快速地通过动物消化道，使营养物质吸收率降低，降低葡萄籽及其他饲料的利用效率[11]。为提高葡萄籽的利用率，缓解新疆南疆饲草料资源短缺的现状，本试验通过添加纤维素酶和木聚糖酶发酵葡萄籽为主混合饲料，期望降低葡萄籽中粗纤维的比例，提高还原糖和其他营养含量，从而有效地提高葡萄籽的营养价值，达到将葡萄籽作为非粮性饲料资源开发利用的目标。

1 材料与方法

1.1 试验原料

葡萄籽购自于新疆伊犁某葡萄酒酿酒厂。棉籽壳、麸皮等饲料原料来自塔里木大学动物科学与技术学院动物实验站。剔除葡萄籽、棉籽壳、麸皮中的杂质，将葡萄籽粉碎，过40 目筛。将葡萄籽、麸皮和棉籽壳按照6∶1∶1的比例混合，混合均匀后装入呼吸袋中，每袋装入100 g样品。

纤维素酶和木聚糖酶，粉末状，袋装，试验所用酶制剂均购于沧州夏盛酶生物技术有限公司，型号为H型100 000 U/g，原封装在阴凉、干燥环境下常温贮存。

1.2 试验设计

本试验采用两因素系统分组试验设计。试验组A1、A2 分别为纤维素酶和木聚糖酶；试验组A3、A4、A5分别为纤维素酶与木聚糖酶按照1∶1、2∶1、1∶2的比例配成的复合酶制剂。样品装入呼吸袋后用单室真空包装机抽真空并封口，放入恒温鼓风干燥箱中，在20、25 ℃和30 ℃发酵24、48、72、96 h，每组设置3 个重复。到达预定时间后称重，开封后取部分样品用于测定pH和氨态氮（NH3-N），其余样品105 ℃烘干保存，用于其他指标的测定。

1.3 指标测定

粗蛋白（CP）含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪（EE）含量使用脂肪浸提仪测定；中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量使用美国ANKOM 2000i全自动纤维分析仪测定。称取发酵样品10 g，加入90 mL纯化水，放入4 ℃冰箱24 h后用四层纱布过滤到烧杯里，使用FiveEasy FE22 pH仪测定pH。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N含量[12]。

1.4 数据统计与分析

所有数据采用SPSS Statistics 26.0 软件中的单因素方差分析（one-way ANOVA）进行显著性检验，LSD多重比较差异，以P＜0.05 为差异显著性判断标准，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同酶制剂20 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响（见表1）

由表1 可知，发酵温度为20 ℃时，发酵96 h 时，试验组A2、A3、A4 粗脂肪含量均显著低于发酵72 h（P＜0.05）；发酵24、48、72 h 时，试验组A1、A5 粗脂肪含量显著低于其他试验组（P＜0.05）。随着发酵时间的延长，试验组A2、A3、A4、A5 的NDF 含量均无显著差异（P＞0.05）。试验组A1的NDF含量在各个时间点均最低，且显著低于其他试验组（P＜0.05）。各试验组在不同发酵时间ADF含量均无显著差异（P＞0.05）。发酵24、48、72 h和96 h时试验组A2、A3的ADF含量较高，在0.32～0.38，且显著高于试验组A1、A5（P＜0.05）。不同时间点添加不同酶制剂发酵样水分含量均差异不显著（P＞0.05）。随着发酵时间增加，试验组A2 的粗蛋白含量均显著高于其他试验组（P＜0.05）。

表1 不同酶制剂20 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响

2.2 不同酶制剂25 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响（见表2）

由表2 可知，发酵温度为25 ℃时，随着发酵时间的延长，96 h 试验组A1、A2、A3、A4 粗脂肪含量明显低于其他时间点（P＜0.05）。相同发酵时间，试验组A3 粗脂肪含量显著低于试验组A1、A5（P＜0.05）。随着发酵时间延长，试验组A3、A4、A5 的NDF 含量差异不显著（P＞0.05）。试验组A2 的NDF 含量显著高于其他试验组（P＜0.05）；试验组A1 的ADF 含量显著高于其他试验组（P＜0.05）。不同发酵时间添加不同酶制剂发酵样水分和粗蛋白含量均无显著差异（P＞0.05）。

表2 不同酶制剂25 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响

2.3 不同酶制剂30 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响（见表3）

由表3 可知，发酵温度为30 ℃时，在发酵24、72、96 h 时，试验组A3 的粗脂肪含量均低于其他试验组（P＜0.05）。随着发酵时间的延长，试验组A1、A2 的NDF 含量差异不显著（P＞0.05）。相同发酵时间，试验组A3 的NDF 含量最低为0.31～0.39，显著低于其他试验组（P＜0.05）。随着发酵时间的增加，试验组A1、A5 的ADF 含量差异不显著（P＞0.05）。相同发酵时间，试验组A1 的ADF 含量最低，在0.20～0.22，显著低于其他试验组（P＜0.05）。不同发酵时间添加不同酶制剂发酵样水分和粗蛋白含量均无显著差异（P＞0.05）。

表3 不同酶制剂30 ℃下发酵葡萄籽对发酵产物常规养分含量的影响

2.4 不同酶制剂20 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响（见表4）

由表4 可知，发酵温度为20 ℃时，随着发酵时间的延长，各试验组pH 逐渐降低。发酵24、48 h 后，均为试验组A5 的pH 最低，为4.79 和4.02，显著低于其他试验组（P＜0.05）。试验组A1 发酵96 h、试验组A2发酵72 h、试验组A3 发酵24 h、试验组A4 发酵48 h后，NH3-N最高分别为8.67、7.13、6.71、7.39 mg/dL，分别显著高于其他时间点（P＜0.05）。发酵24 h 的试验组A3、发酵48 h的试验组A4、发酵72 h的试验组A2、发酵96 h 的试验组A1 的NH3-N 含量最高，分别为6.71、7.39、7.13、8.67 mg/dL，显著高于其他试验组（P＜0.05）。

表4 不同酶制剂20 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响

2.5 不同酶制剂25 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响（见表5）

表5 不同酶制剂25 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响

由表5 可知，发酵温度为25 ℃时，各试验组在相同发酵时间内pH 均无显著差异（P＞0.05）；随着发酵时间的延长，各试验组的pH逐渐降低，24 h各试验组的pH均显著高于其他时间点（P＜0.05）。发酵24 h的试验组A2、发酵96 h的试验组A1的NH3-N均显著低于其他试验组（P＜0.05）；发酵48 h的A4显著高于其他试验组（P＜0.05）。

2.6 不同酶制剂30 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响（见表6）

表6 不同酶制剂30 ℃下发酵葡萄籽对pH、NH3-N的影响

由表6 可知，发酵温度为30 ℃时，随着发酵时间的延长，发酵24 h 的试验组A1、A2、A5 的pH 显著高于其他时间点（P＜0.05）；发酵48、72、96 h 时各试验组pH 均无显著差异（P＞0.05）。试验组A1 发酵72 h和96 h、试验组A3 发酵24 h、试验组A5 发酵24 h 和48 h 后NH3-N 显著高于其他时间点（P＜0.05）；发酵24 h 的试验组A3、发酵48 h 的试验组A5、发酵72 h和96 h 的试验组A1 的NH3-N 显著高于其他试验组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 不同发酵时间和酶制剂对葡萄籽发酵后常规营养成分的影响

葡萄籽发酵后的常规营养物质主要包括水分、CP、EE、NDF 和ADF。干物质过低，营养成分不足，不易发酵；干物质过高，发酵后样品纤维老化，适口性降低，限制采食量，也不易压实。NDF 和ADF 是反映适口性和采食量的指标，含量越低，说明适口性越好。本试验结果表明，添加不同酶制剂发酵葡萄籽提高了饲料脂肪含量，显著降低了饲料中的ADF、NDF 含量，蛋白质含量无显著变化。发酵后CP 含量为0.08～0.20，EE 含量为0.07～0.19，ADF 和NDF 含量大致为0.30 左右。试验组A1 在25 ℃和30 ℃对营养物质改善效果最佳。这与南珊珊等[13]研究葡萄籽粕发酵后常规营养成分含量类似。各试验组发酵结束后，常规养分含量指标有一定波动，这与王涛等[14]研究不同酶制剂对以玉米秸秆为主要纤维来源的FTMR 发酵品质结果一致，主要原因是添加酶制剂引起纤维素的降解，以及发酵过程中产生的微生物的分解作用。研究结果表明，蛋白质和脂肪含量较高，ADF 和NDF 含量降低，导致这种现象的原因是纤维素酶和木聚糖酶协同作用于细胞壁，破坏并降解了纤维素和半纤维素，使得蛋白质含量增加。

3.2 不同发酵时间和酶制剂对葡萄籽发酵后综合品质的影响

研究表明，pH 的变化趋势是葡萄籽发酵成功与否的最直接标志。从本试验结果来看，各试验组pH降低，随着发酵时间的延长，发酵周期内pH的变化趋势主要为先降低后趋于平缓。在相同的发酵时间内，复合酶1∶2 试验组（A5 组）的pH 大都低于其他试验组。丁浩等[15]研究在象草青贮中添加纤维素酶和木聚糖酶造成pH下降，与本试验结果一致，原因是添加酶制剂促进了粗纤维的降解，释放水溶性碳水化合物，加快了乳酸的产生速度，从而降低了pH。

NH3-N 是青贮饲料蛋白质保存或分解的重要评判指标之一[16]，当饲料中蛋白质被微生物利用时，饲料中的氨态氮就会增加。一般情况下，若NH3-N 在10 mg/dL 以下，则表明发酵过程良好，本试验得出发酵葡萄籽NH3-N为3～8 mg/dL，随着发酵时间增加，各试验组NH3-N 先升高后降低。由于葡萄籽原料来自于酿酒厂，所以原料中本身就含有一定适合发酵的微生物，所以发酵过程中前期NH3-N 呈现出增加趋势。在不同发酵温度下，试验组A5 对发酵品质改善效果最优。在整个发酵过程中，NH3-N 呈较低水平，这可能是由于添加酶制剂发酵后，乳酸含量升高、pH 降低，抑制了有害微生物的生长活性，减少了对蛋白质的降解，造成NH3-N比值降低。

4 结论

本试验条件下，纤维素酶与木聚糖酶1∶2、在20 ℃发酵72 h，可不同程度改善葡萄籽为主混合饲料的发酵效果，是制作发酵饲料的适宜参数。