海洋胶红酵母发酵玉米加工副产物产类胡萝卜素的研究

■王砚妮 李 敏 黄 满 段先莉 王永泽 赵锦芳

（湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉 430068）

类胡萝卜素是一类重要的天然色素，除作为维生素A 的前体外，其主要的生物活性功能有抗氧化、抗炎、预防癌症和免疫反应特性，广泛用于食品、化妆品、医药、保健品和动物饲料等领域。类胡萝卜素可通过植物提取、化学合成和微生物发酵3 种途径获得，其中微生物发酵法因其无毒无害、影响因素少、生产周期短等优点，具有广阔的开发前景[1]。

目前，国内外微生物发酵生产类胡萝素的菌种主要有霉菌类、酵母类、细菌类和藻类[2]。其中，红酵母属主要有海洋胶红酵母（R. mucilaginosaD）[3-6]、粘红酵母（R. glutinis）[7-8]、深红酵母（R. rubra）[9]、法夫红酵母（Phaffia rhodozyma）[10]、小红酵母（R. minuta）[11]和瘦果红酵母（R. acheniorum）[12]等。由于红酵母对营养要求较简单，国内外大量研究集中在利用工业废料和农产品加工副产物进行发酵生产类胡萝卜素上，以降低其生产成本，增加市场竞争力。研究证实甘蔗汁、玉米浆、糖蜜、啤酒糟、洋葱皮和绿豆壳[5]、马铃薯加工废水[13]等都可作为红酵母发酵的培养基成分。

玉米浆（corn steep liquor，CSL）和葡萄糖废液（glucose mother liquor，GML）是玉米淀粉加工过程中的两大副产物，玉米浆为玉米的亚硫酸浸泡液，经真空浓缩后得到的黄褐色液体，含有可溶性蛋白、多种氨基酸、无机盐、生长因子及前体物质等，可用作水溶性植物蛋白、复合肥料添加剂和纤维饲料[14]。在生物制药、氨基酸发酵和酶制剂等领域中，常被用作廉价高效的有机氮源使用，以节约生产成本，提高玉米浆的附加值[15-16]。葡萄糖废液是玉米淀粉加工生产结晶葡萄糖的过程中产生的，其固形物含量为40%～55%，其中除葡萄糖外还含有大量的低聚糖组分[17]。每生产100 万吨结晶葡萄糖约产生20 万吨葡萄糖废液。两种副产物外卖价格低，储存期易变质，环保和库存压力大。如何合理、有效地回收利用CSL 和GML，是玉米深加工产业实现循环经济发展的关键问题。利用CSL为氮源，GML为碳源发酵生产高蛋白酵母增色饲料是一种有效途径。

本研究以海洋胶红酵母（R. mucilaginosaD）为出发菌株，在实验室前期优化培养基组分、控制发酵条件的基础上[18-20]，进一步对其利用CSL 和GML 生产类胡萝卜素的发酵条件进行优化，以提高类胡萝卜素产量，为后续中试规模生产提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

海洋胶红酵母（R. mucilaginosaD），由本实验室分离筛选获得，保藏于湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室。

1.1.2 试剂

玉米浆（CSL）和葡萄糖废液（GML）由山东某药业公司提供，新鲜制备，4 ℃储藏。CSL为玉米的亚硫酸浸泡液，经真空浓缩后得到的黄褐色液体，其中固形物含量6.5%，总氮含量约为1%；GML 为葡萄糖母液经部分回收及浓缩后得到的液体，葡萄糖含量约为50%；酵母粉、蛋白胨和琼脂粉为进口（OXOID公司），其他试剂均为市售国产分析纯。番茄汁自制，花生油为食用级。

1.1.3 主要仪器

7 L 发酵罐（sartorius stedim Biotech GmbH37070 Gottigen Germany）；100 L 发酵罐（GUJS-15-100C，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司生产）；生物传感分析仪（SBA-40D，山东省科学研究院），分光光度计[WF J 2000，尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.1.4 培养基

斜面活化培养基（g/L）：麦芽汁50、葡萄糖20、酵母粉20、琼脂20，pH自然。

种子培养基（g/L）：葡萄糖10、蛋白胨10、酵母粉0.5，pH自然。

摇瓶发酵培养基：GML 8%、CSL 33%，pH自然。

7 L发酵培养基：GML、CSL适量，pH自然。

100 L 发酵培养基：GML 13%、CSL 42%、K2HPO45.5 g、MgSO427.5 g、（NH4）2SO4110 g、甘油1‰，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株发酵

种子培养：将海洋胶红酵母菌株（R. mucilaginosaD）从保存培养基转接到斜面活化培养基上，28 ℃条件下培养48 h 之后，接2 环菌苔于种子培养基中，28 ℃振荡（200 r/min）培养18 h至对数生长期。

摇瓶发酵培养：装液量50 mL/250 mL 摇瓶发酵培养基中，接种量10%，然后分别添加比例为1‰的甘油、番茄汁和花生油，28 ℃振荡（200 r/min）培养72 h，测定生物量和类胡萝卜素产量。空白对照（CK）为纯化水，3次重复。

7 L发酵罐：发酵罐中装液量4 L，接种量10%，设置不同的溶氧条件和干物质含量，温度28 ℃，72 h时取样，测定生物量和类胡萝卜素含量，重复3次。

100 L 发酵罐：发酵罐中装液量60 L，接种量10%，温度28 ℃，溶氧量20%～30%。每4 h取样，测定OD600nm、pH、残糖和类胡萝卜素产量。

1.2.2 类胡萝卜素产量测定

酸热破壁法[18]：取4 mL 发酵液，3 500 r/min 离心15 min得到湿菌体，加入6 mL 3 mol/L HCl溶液，室温下振荡浸泡1 h，在沸水浴中煮沸4 min，迅速冷却后于3 500 r/min离心15 min。弃去上清液，沉淀用纯化水洗2～3次后加入5 mL丙酮，室温下振荡以浸提类胡萝卜素，然后3 500 r/min离心15 min，所得上清液即为类胡萝卜素提取液。重复3次，以保证色素提取完全。

将提取液适当稀释后用分光光度计在最大吸收波长475 nm处测定吸光度，按公式计算类胡萝卜素产量。

单位体积发酵液的类胡萝卜产量（μg/mL）=A×D×V/0.16×W

式中：A——类胡萝卜素最大波长处的吸光度；

D——色素浸提液稀释倍数；

V——浸提所用溶剂的总体积（mL）；

W——提取所用的发酵液体积（mL）；

0.16——胡萝卜素的摩尔消光系数。

1.2.3 细胞生物量测定方法

参照罗璇等[21]的干重法：取5 mL发酵液，3 500 r/min离心15 min，弃去上清液，加入30 mL 的纯化水分次洗涤，使用四层纱布过滤得到菌液，离心得湿菌体，60 ℃烘箱中烘干至恒重，然后称取干菌体的重量即生物量。

1.2.4 残糖浓度测定

用SBA-40D 生物传感仪测定，标准样品为100 mg/dL葡萄糖，具体方法为：运行仪器进行自动清洗，自动定标，取标准样品进行样品测定。

1.3 数据统计与分析

实验数据使用SPSS 26.0（Statistical Product and Service Solutions）进行方差分析，显著性水平设置为P＜0.05，实验数据表示为“平均值±标准差”。采用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 促进因子对海洋胶红酵母发酵的影响（见图1）

图1 促进因子对红酵母发酵的影响

据相关文献报道[7，22]，金属离子、维生素、番茄汁、花生油、棉籽油等对红酵母发酵产类胡萝卜素有不同程度的促进作用。在前期研究中，通过单因素实验确定了摇瓶发酵培养基中葡萄糖废液添加量8%，玉米浆添加量33.3%，在此基础上，向培养基中分别添加1‰的甘油、番茄汁和花生油，考察3种促进因子对海洋胶红酵母产类胡萝卜素的影响，发酵结果如图1所示。

甘油可作为微生物发酵的碳源，有研究证实甘油可作为酵母菌渗透压稳定剂[23]。本实验中，添加1‰甘油能显著提高红酵母生物量（图1b），与CK组相比提高了58.19%，类胡萝卜素的产量提高了19.11%，达到6.54 mg/L。推测主要原因是在高渗环境中，其能维持红酵母细胞渗透压的平衡，同时参与脂质代谢的调节并由此影响细胞膜的通透性。

添加番茄汁和花生油后，红酵母生物量和色素产量也均有所提高，其中添加1‰番茄汁，R. mucilaginosaD 类胡萝卜素产量和生物量分别比CK 组提高了12.2%和13.5%。番茄汁中含有合成类胡萝卜素的前体物质八氢番茄红素和四氢番茄红素，它们经过环化作用形成β-类胡萝卜素，因此对菌体合成类胡萝卜素有促进作用；向培养基内添加花生油时，可能是由于类胡萝卜素在生物体内一般以油滴形式储存，所以会影响红酵母的脂类代谢，加快菌体生长，同时对类胡萝卜素的生成有一定促进作用[22]。

2.2 溶氧量对海洋胶红酵母发酵的影响（见表1）

在7 L发酵罐中，GML 8%、甘油1‰，通过改变转速和通气量，设置不同的溶氧条件：0～10%、10%～20%、20%～30%，研究溶氧对海洋胶红酵母发酵产类胡萝卜素的影响。发酵结果见表1。酵母菌生长和发酵过程中，溶氧量的控制极为重要。由表1可见，溶氧量与类胡萝卜素产量之间呈正相关。在溶氧量为0～10%时，海洋胶红酵母的类胡萝卜素产量很低，仅有3.83 mg/L，因为较低的溶氧量不利于菌体对氧的充分吸收，影响了色素的产生。在溶氧量为20%～30%时，海洋胶红酵母的类胡萝卜素产量最高，达到15.16 mg/L，此时的生物量也最高。说明，高溶氧量适宜红酵母菌体的生长，并有利于类胡萝卜素的生成。因此，将溶氧控制在20%～30%为佳。

表1 不同溶氧对红酵母发酵的影响

2.3 固形物含量对海洋胶红酵母产类胡萝卜素的影响（见表2）

表2 固形物含量对红酵母发酵的影响

类胡萝卜素产量与发酵原料的营养含量有很大关系，本研究CSL和GML中均含有一定量的不溶性固形物，在7 L发酵罐中，通过调整两者添加配比，研究不同固形物含量对海洋胶红酵母发酵产类胡萝卜素的影响。发酵结果见表2。

CSL（氮源）和GML（碳源）中均有不溶性物质，通过调整两者比例，使固形物含量分别为8%、11%和14%。随着固形物含量的增加，类胡萝卜素产量呈现出先升高后下降的趋势。当培养基中固形物含量为8%时，CSL 和GML 的浓度均较低，此时营养成分较少，菌株的生长和代谢能力弱，因而所得生物量和色素产量均较低；当增加CSL 和GML 的配比，使固形物含量为11%时，充足的营养成分促进菌体细胞的生长，OD600nm达到最大值150，类胡萝卜素产量为25.77 mg/L。进一步提高固形物含量至14%时，OD600nm和类胡萝卜素产量均下降，主要原因是高浓度的CSL 和GML 导致渗透压增大，对红酵母菌体的生长和类胡萝卜素的形成产生一定的抑制作用。因此固形物含量为11%时效果最佳，即CSL 42%、GML 13%。

2.4 100 L发酵罐实验（见图2）

图2 海洋胶红酵母100 L发酵罐结果

在100 L 发酵罐中，固形物含量11%，甘油1‰，通气搅拌发酵使溶氧量维持在20%～30%，发酵过程中定时取样，检测残糖、pH、OD600nm和类胡萝卜素产量的变化，结果如图2所示。

发酵过程中pH不做调整，基本在3.5～4.5之间小幅变动。发酵液中有植酸的存在，对酵母生长和类胡萝卜素的产生是不利因素，后期考虑采用方法去除原料中的植酸。

由图2可知，从残糖的变化可以看出，发酵至8 h时，菌体进入对数生长期（8～28 h），这一阶段葡萄糖的利用速率加快，浓度随着发酵时间的增加急剧下降，至24 h 时完全被消耗。随着OD600nm值的变化，类胡萝卜素产量迅速升高，两者的增长趋势保持一致。至28 h时，OD600nm达到最大148.4，类胡萝卜素产量也达到最大值26.17 mg/L，之后进入稳定期，OD600nm和pH 基本维持不变。达到最大值后，残糖的快速消耗使类胡萝卜素产量出现小幅下降趋势。发酵过程中菌株的生长（OD600nm）和类胡萝卜素产量的变化趋势保持一致，这与Ghilardi等[4]报道的结果一致。

利用工农业加工副产物发酵生产类胡萝卜素是近几年研究的热点方向。不同菌株以不同的农产品加工废物为发酵原料所产生的类胡萝卜素含量差异明显。Marova等[24]研究R. mucilaginosaCCY 20-7-31利用合成培养基（酵母提取物、维生素、马铃薯废料）作为营养物，同时添加过氧化物和5%盐胁迫，经有氧发酵生物量最高达30 g/L，β-胡萝卜素产量可达到56 mg/L。Anna等[13]研究不同红酵母利用马铃薯废水和3%的甘油作为碳源，在5%NaCl盐胁迫、5 mmol/L H2O2胁迫条件下生产类胡萝卜素，发酵120 h后的产物进行喷雾干燥，R. glutinisLOCKR13、R. mucilaginosaATCC 66034和R. gracilisATCC 10788的总类胡萝卜素含量分别为280.3、150.7 μg/g（干基）和360.4 μg/g（干基）。Sinisa 等[25]研究Sporobolomyces roseus以咖啡渣为碳源进行分批补料发酵生产类胡萝卜素，发酵41～48 h 类胡萝卜素含量最大为41 g/L。2021年，Luis等[26]研究不同红酵母利用甜菜渣（SBP）水解物为碳源，有氧发酵生产类胡萝卜素，经过144 h 发酵后，R. mucilaginosaIST 390和R. toruloidesPYCC 5615的总类胡萝卜素产量分别为1.4 mg/L 和5.4 mg/L。Aksu[27]等研究R. mucilaginosaNRRL-2502利用两种农业加工副产物为碳源，通过摇瓶发酵生产类胡萝卜素。在最佳发酵条件下，海洋胶红酵母以甜菜糖蜜（蔗糖浓度20 g/L）为碳源时，其类胡萝卜素产量可达到89.0 mg/L，以乳清（乳糖浓度为6.6 g/L）为碳源时，其类胡萝卜素产量可达到70.0 mg/L。Tabita 等[6]研究R. mucilaginosaCCT 7688利用蔗糖糖蜜（蔗糖浓度70 g/L）和玉米浆（玉米浆浓度3.4 g/L）作为营养物质，通过500 mL摇瓶发酵产类胡萝卜素。在25 ℃，180 r/min 的条件下经过168 h 发酵后，类胡萝卜素的产量可达到152.5 μg/g。本研究以玉米浆和葡萄糖废液为发酵原料，添加促进因子、改变溶氧量和固形物含量，经过28 h发酵后，类胡萝卜产量可达26.17 mg/L。研究表明，红酵母可利用玉米淀粉加工副产物——玉米浆和葡萄糖废液发酵生产类胡萝卜素，既可增加这些副产品的附加值，降低发酵成本，又可以减少对环境的影响。

3 结论

玉米浆（CSL）和葡萄糖废液（GML）是玉米淀粉加工副产物，本研究对海洋胶红酵母利用玉米浆和葡萄糖废液的发酵条件进行优化，得到最佳工艺条件为：固形物含量11%（GML 13%、CSL 42%）、甘油添加量1‰、10%接种量、溶氧量20%～30%、发酵温度28 ℃、pH 自然。类胡萝卜素的产生主要发生在对数生长期，发酵至28 h时，OD600nm达到最大值，类胡萝卜素的产量最高达到26.17 mg/L。

本研究中海洋胶红酵母R. mucilaginosaD 能利用玉米淀粉深加工副产物稳定生产类胡萝卜素，综合前期研究结果，所得产品粗蛋白含量达到30%以上，具有进一步开发潜力。本研究为规模化生产高蛋白酵母增色饲料及玉米加工副产物的综合利用提供技术参考。