混合益生菌对奶牛瘤胃发酵的影响

■房 峥 王 聪 刘 强

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷 030801）

畜禽饲养使用抗生素，存在病原菌产生耐药性、破坏动物消化道内菌群平衡和畜产品残留的问题，为此，世界各国相继禁止使用抗生素，寻找抗生素的替代品刻不容缓[1]。有研究表明[2]，日粮添加1×1011CFU/d的纳豆枯草芽孢杆菌，能显著提高奶牛瘤胃微生物数量，提高饲料效率，进而提高瘤胃总挥发性脂肪酸（TVFA）含量；Beauchemin等[3]发现日粮添加6×109CFU/d的粪肠球菌能显著提高肉牛瘤胃丙酸含量，显著降低乙丙比；姜艳美等[4]发现在人工瘤胃中添加6.25×106CFU/mL 发酵液的粪肠球菌能提高发酵液中氨态氮（NH3-N）浓度和原虫数量；Van Koevering等[5]报道，奶牛日粮中添加嗜酸乳杆菌能降低瘤胃中乳酸浓度，因此奶牛日粮添加嗜酸乳杆菌能预防奶牛产生瘤胃酸中毒的症状，有利于维持奶牛瘤胃代谢的正常进行。

综合前人研究结果可知，日粮添加益生菌能促进奶牛瘤胃有益菌生长，进而提高饲料效率和瘤胃发酵水平。但由于受到瘤胃内环境及瘤胃微生物的影响，不同补充方式的益生菌进入奶牛瘤胃后的效果尚不明确。故有必要对外源微生物与瘤胃菌群之间的互作效应以及益生菌的最佳使用方式进行探究。本试验通过研究益生菌对奶牛瘤胃发酵的影响，明确外源微生物与瘤胃菌群之间的互作效应，有助于丰富反刍动物瘤胃营养代谢调控理论，试验的开展具有一定的理论意义；通过比较不同益生菌补充方式饲喂效果，明确益生菌的最佳使用方式，为生产中科学有效利用益生菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用的益生菌原菌粉（其中嗜酸乳杆菌原菌粉的活菌数为1.0×1011CFU/g；枯草芽孢杆菌原菌粉的活菌数为1.6×109CFU/g；粪肠球菌原菌粉的活菌数为1.0×1011CFU/g）均为饲料级，购自山西大禹生物工程股份有限公司。

混合益生菌（MP）的制备：依据山西省特色奶牛生产重点科技创新团队之前的研究成果以及嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌的生物学特性，将嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌原菌粉按4∶15∶1的比例混合均匀后制成。

包被混合益生菌（CMP）的制备：包被混合益生菌由山西省特色奶牛生产重点科技创新团队自主研制而成，含菌量为50%。

1.2 试验动物

选用44 头、体重（632±9.2）kg、泌乳天数（113.7±15.4）d体况良好的经产荷斯坦奶牛。

1.3 试验设计及饲养管理

依据体重和泌乳天数，将44 头健康荷斯坦奶牛按随机区组设计分为4 组：①对照组饲喂基础日粮；②MP 组饲喂基础日粮+1 g/kg DM MP；③CMP 组饲喂基础日粮+2 g/kg DM CMP；④HMP组饲喂基础日粮+0.5 g/kg DM MP+1 g/kg DM CMP。

试验期共80 d，包括预试期20 d和正试期60 d。

奶牛全混合日粮（TMR）精粗比为50∶50，依据NRC（2001）配制[6]，日粮组成和营养水平见表1。试验牛分为两个圈舍，单栏饲养，自由采食和饮水。为了保证TMR的新鲜性，每天分两次（5：00和14：00）投喂TMR。每次饲喂前将添加剂均匀搅拌在少量TMR中，待试验牛采食完毕后再投喂剩余TMR。

表1 基础日粮组成及营养水平（DM，%）

1.4 瘤胃液的采集

正式试验期的第60天，晨饲后3 h，用胃管采集试验牛瘤胃液100 mL。用PHSJ-4A型酸度计（上海精密科学仪器有限公司，中国上海）测定瘤胃液pH后，将瘤胃液用4层纱布过滤，分成4份，两份于-20 ℃保存，用于测定NH3-N和挥发性脂肪酸（VFA），两份于-80 ℃保存，用于菌群的测定。

1.5 样品的测定

1.5.1 瘤胃液NH3-N和VFA的测定

瘤胃NH3-N浓度的测定采用比色法，利用紫外可见分光光度计（UV2100，上海优尼科仪器有限公司）测定标样及样品的吸光度值后，根据标样的浓度及吸光度值所构建的标准曲线来计算瘤胃液中NH3-N 的浓度[7]。瘤胃液VFA采用气相色谱仪（GC122，上海精密科学仪器有限公司）测定[7]。

1.5.2 瘤胃液酶活性的测定

瘤胃液中纤维素分解酶、蛋白酶以及淀粉酶活性的测定采用比色法[8]。在40 ℃和pH为7的条件下，瘤胃液中的纤维素酶和淀粉酶能分别将纤维素类底物和可溶性淀粉水解为还原糖，蛋白酶能将酪素底物水解产生含有酚基的氨基酸；还原糖或酚基氨基酸与3,5-二硝基水杨酸或Folin 试剂发生反应，生成橙色或蓝色产物，其颜色深浅与还原糖或酚基氨基酸含量成正比；使用分光光度计（波长540 nm 或680 nm 处）测定样品的吸光度，绘制标准曲线，再计算还原糖或酚基氨基酸的生成量和酶的活性。漆酶在40 ℃和pH为7的条件下能与2,2-连氮-二（3-乙苯基并噻唑-磺酸）反应生成绿色产物，其颜色深浅与产物浓度成正比，使用分光光度计（波长420 nm 处）测定样品的吸光度，计算漆酶的活性。

1.5.3 瘤胃液菌群的测定

向瘤胃液中加入研磨珠与溴化十六烷三甲基铵，用研磨珠均质器破碎，离心后取上清液，用DNA提取液反复提取，最后加入异戊醇、乙醇进行沉淀，DNA沉淀溶于超纯水后测定[7]。

引物购买自北京华大基因科技股份有限公司，信息见表2。按照TaKaRa试剂盒上的说明（由北京宝日医生生物技术有限公司生产），使用美国ABI Step OnePlus 的仪器进行Real-time PCR，记录拷贝数。标品自行制备，反复调试以使扩增效率达90%～110%，标准曲线中的R2≥0.999，之后进行样品DNA 的Realtime PCR 测定。PCR 扩增引物和详细步骤参考武晓旭[7]发表的方法。

表2 瘤胃菌群RT-PCR检测引物

1.6 数据处理及统计分析

对于瘤胃发酵、瘤胃酶活、瘤胃菌群各指标采用one-way ANOVA 模型进行统计分析，采用Duncan's法进行多重比较，当P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 混合益生菌对奶牛瘤胃发酵的影响（见表3）

表3 混合益生菌对奶牛瘤胃发酵的影响

由表3 可知，HMP 组瘤胃液pH 显著低于对照组和CMP 组（P＜0.05）；MP 组和HMP 组TVFA 含量显著高于对照组和CMP组（P＜0.05）；MP组和HMP组乙酸摩尔比显著低于对照组和CMP 组（P＜0.05）；MP 组和HMP 组丙酸摩尔比显著高于对照组（P＜0.05）；MP 组和HMP组戊酸摩尔比最高，CMP组次之，对照组最低（P＜0.05）；MP组、HMP组异丁酸和异戊酸摩尔比显著高于对照组和CMP组（P＜0.05）；MP组和HMP组乙丙比显著低于对照组和CMP组（P＜0.05）；丁酸摩尔比和NH3-N浓度，各组间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 混合益生菌对奶牛瘤胃微生物酶活性的影响（见表4）

表4 混合益生菌对奶牛瘤胃微生物酶活性的影响

由表4 可知，瘤胃液中羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和α-淀粉酶活性，各组间差异不显著（P＞0.05）；木聚糖酶、果胶酶和蛋白酶活性，MP 组和HMP 组显著高于对照组和CMP组（P＜0.05）；MP组和HMP组漆酶活性显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3 混合益生菌对奶牛瘤胃菌群的影响（见表5）

表5 混合益生菌对奶牛瘤胃菌群的影响

由表5可知，瘤胃液中总细菌、总厌氧真菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和栖瘤胃普雷沃氏菌的数量，各组间差异不显著（P＞0.05）；MP组和HMP组总原虫的数量显著低于对照组和CMP 组（P＜0.05）；MP 组和HMP 组总产甲烷菌的数量显著低于对照组（P＜0.05）；HMP组产琥珀丝状杆菌的数量显著高于MP组（P＜0.05），与对照组和CMP 组间差异不显著（P＞0.05）；MP 组、HMP 组溶纤维丁酸弧菌的数量显著高于对照组和CMP组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 混合益生菌对奶牛瘤胃发酵的影响

瘤胃pH 作为反映瘤胃内环境的重要指标，影响奶牛的瘤胃发酵水平。日粮补充HMP，显著降低了瘤胃pH。Sun 等[9]同样提出，在奶牛日粮中分别添加0.5×1011CFU/d和1.0×1011CFU/d纳豆枯草芽孢杆菌，试验奶牛瘤胃pH均显著降低。反刍动物能量的来源主要是日粮中碳水化合物在瘤胃中发酵所产生的VFA，而瘤胃产生和吸收VFA这一动态变化过程受到多种因素影响[10]。日粮中补充MP 和HMP，显著提高了瘤胃中TVFA含量。瘤胃TVFA含量的提高是因为日粮补充MP和HMP显著提高了瘤胃中B. fibrisolvens和R. amylophilus的数量。B. fibrisolvens和R. amylophilus能分泌纤维素酶（包括木聚糖酶、果胶酶和漆酶）、蛋白酶和α-淀粉酶，提高了日粮在瘤胃的降解率。孙满吉等[11]在日粮中添加4.0×1010CFU/d酵母培养物，显著提高了瘤胃中TVFA 含量，与本研究结果相同。日粮补充MP 和HMP 显著降低了瘤胃乙酸摩尔比，显著提高了丙酸摩尔比，乙酸/丙酸值降低，使瘤胃发酵模式向产生更多的丙酸转变，有利于反刍动物的生长和生产。刘彩娟等[12]同样发现，在奶牛日粮中添加1.2×1011CFU/d 复合益生菌，显著增加了瘤胃丙酸含量，降低了乙酸/丙酸值。在瘤胃发酵产生的VFA中，有少量由支链氨基酸代谢后产生的支链脂肪酸（主要有戊酸、异戊酸和异丁酸等）。戊酸由碳水化合物或脯氨酸等降解产生，异戊酸和异丁酸由支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）经氧化脱氨或脱羧基产生[13]。日粮补充MP和HMP，瘤胃中戊酸、异戊酸和异丁酸摩尔比显著提高，与Lascano 等[14]的研究结果一致。瘤胃NH3-N 浓度能够反映瘤胃MCP 合成、日粮CP 降解之间的平衡，反映瘤胃微生物对日粮中氮源的降解和利用情况[15]。日粮补充MP、CMP 和HMP，瘤胃内NH3-N 浓度无显著变化，与瘤胃内总细菌数量无显著变化的结果一致。Yang等[16]发现，日粮中添加1.0×1010CFU/d的丙酸杆菌与粪肠球菌复合制剂，瘤胃NH3-N浓度无显著变化，与本研究结果一致。

日粮添加MP 和HMP，瘤胃TVFA 含量和丙酸摩尔比显著提高。日粮添加CMP，对瘤胃TVFA 含量无显著影响。因此，MP 直接添加或包被与不包被混合添加均对奶牛瘤胃发酵有积极的影响。

3.2 混合益生菌对奶牛瘤胃酶活性和菌群的影响

瘤胃内酶的活性与瘤胃菌群数量有关，二者均可间接反映营养物质在瘤胃中被降解的能力[15]。R.albus、R. flavefaciens、B. fibrisolvens和F. succinogenes主要分泌纤维素酶；B.fibrisolvens、R.amylophilus和P.ruminicola主要分泌α-淀粉酶和蛋白酶[17]。在本试验中，日粮补充MP和HMP显著提高了瘤胃中纤维素酶（包括木聚糖酶、果胶酶和漆酶）和蛋白酶的活性，与Kubo等[18]的研究结果一致。日粮补充MP和HMP显著提高了瘤胃中木聚糖酶、果胶酶和漆酶的活性，与B. fibrisolvens数量增加的结果相一致。冯伟业等[19]的试验同样发现，添加益生酵母培养物，瘤胃木聚糖酶和果胶酶活性增加。日粮补充MP和HMP显著提高了蛋白酶的活性，与B.fibrisolvens和R.amylophilus的数量提高的结果一致。

日粮补充MP 和HMP 显著降低了产甲烷菌和总原虫数量。产甲烷菌数量的降低与补充MP 和HMP后丙酸含量的提高和总原虫数的减少有关。丙酸含量的提高，竞争性地消耗了瘤胃中的氢，减少了产甲烷菌生长增殖所需的底物[20]，导致其数量减少。日粮补充MP、CMP和HMP，奶牛瘤胃R. albus和R. flavefaciens数量无显著变化。但是，邓璐芳[2]的研究发现，奶牛日粮中添加1.0×1011CFU/d 纳豆枯草芽孢杆菌，瘤胃R. albus和R. flavefaciens数量显著增加。研究结果不一致的原因，可能是两个试验奶牛瘤胃pH 的不同所造成的。邓璐芳[2]的试验中，处理组pH 为6.66，本试验MP 组、CMP 组和HMP 组pH 分别为5.87、6.12 和5.61。R. albus和R. flavefaciens属于纤维分解菌，较低的瘤胃pH（低于6.2）则会抑制纤维分解菌增长[21]。日粮补充MP和HMP显著提高了瘤胃内B. fibrisolvens和R. amylophilus的数量。邓璐芳[2]研究表明，奶牛日粮中添加1.0×1011CFU/d 纳豆枯草芽孢杆菌，瘤胃B. fibrisolvens和R. amylophilus的数量显著提高，P. ruminicola的数量未发生显著变化，与本研究结果相同。

日粮补充MP 显著提高了瘤胃中木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶和漆酶的活性，以及瘤胃内B. fibrisolvens和R. amylophilus的数量。日粮补充CMP，因采用过瘤胃技术处理益生菌，对消化酶活性及瘤胃菌群数量无显著影响。日粮补充HMP显著提高了瘤胃中木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶和漆酶的活性，同时显著提高了瘤胃内B. fibrisolvens和R. amylophilus数量。但是HMP组中F. succinogenes的数量显著高于MP 组。综合比较，HMP为益生菌的最佳补充方式。

4 结论

混合益生菌能促进瘤胃发酵功能，奶牛日粮中混合益生菌的最佳补充方式为包被和不包被等比例混合添加。