重组猪抑制素的高密度发酵生产条件优化

李辉　翟颖超　施振旦

摘要： 抑制素（INH）是性腺组织分泌的一种糖蛋白，可通过抑制促卵泡素分泌和性腺组织发育，在动物繁殖活动中起着重要的调控作用。通过对INH α亚基免疫，中和动物体内的INH，可解除INH对动物繁殖活动的抑制作用，从而提高动物的繁殖力。为获得大量重组的INH α亚基蛋白，满足生产的需要，本研究对发酵罐高密度发酵工艺进行探索，并分别对发酵培养基的类型、乳糖诱导浓度、诱导时间进行优化。结果表明，采用TB培养基发酵至20 h，菌体D600 nm值达到最大，为22 84，菌体总湿质量为25 48 g/L，显著高于其他2种培养基，综合比较细菌生长趋势、菌体总湿质量以及培养基成本等因素，TB培养基较适用于重组INH的发酵罐生产；终浓度为10 g/L的乳糖诱导5 h可达到最高蛋白表达量，占菌体总蛋白的50%以上，发酵结束时D600 nm值达到36，细菌总湿质量达到28 66 g/L。

关键词： 抑制素；高密度发酵；乳糖诱导；发酵罐

中图分类号： TQ920 6 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0207-04

抑制素（inhibin，INH）是由性腺组织（卵巢、睾丸）分泌的糖蛋白激素，由α、β亚基通过二硫键连接形成异源二聚体 [1-2]。其中α亚基为INH独有，β亚基则与激活素（activin）共用，2个β亚基通过二硫键组成同源二聚体，即为activin [2- 3]。INH具有抑制促卵泡素（FSH）分泌的功能 [4]，还具有直接抑制性腺发育及其功能的作用 [5]。因此，主动或被动免疫INH α亚基，中和动物体内INH的生物活性，可促进垂体分泌FSH，解除INH对性腺功能的抑制，最终缓解INH对动物生殖活动的抑制作用，促进动物繁殖活动。前期研究证实，主动或被动免疫INH α亚基可以显著提高羊、猪、牛、水牛等动物的发情表现、排卵数、卵子质量、受胎率、产仔数 [6-10]。对蛋鸡免疫也起到类似作用，主要表现在显著提高其产蛋率 [11]。对公畜进行INH α亚基免疫同样会产生积极作用，主要表现在性成熟提前、睾丸质量和体积增加、精子产生量增加和质量提高等 [12- 13]。江苏省农业科学院动物品种改良和繁育重点实验室进一步研究发现，免疫INH α亚基对夏季高温应激导致的母畜乏情和公畜精子质量下降、母畜产后乏情以及提高种畜的使用年限等具有显著效果 [12]。综上，笔者认为重组INH在畜牧业生产中具有较广泛的应用前景，并蕴藏着可观的商业价值。

目前所用的INH已经由摇瓶培养原核表达的重组INH全面代替成本较高的人工化学合成的INH。但是在实际生产中，摇瓶培养效率太低，不能满足畜牧业生产中的巨大需求。为提高生产效率，笔者首次引入发酵工业中的高密度发酵（high cell-density fermentation，HCDF）工艺。高密度发酵是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。通过优化发酵过程中的多个相关因素，可以提高菌体数量和单细菌内蛋白表达量，最终达到提高目标蛋白产量的目的 [14- 15]。目前，大肠杆菌高密度发酵技术广泛应用于多种重组蛋白的发酵生产中 [16-21]，并取得了较好效果。然而，当前对于重组猪INH α亚基的大肠杆菌高密度发酵研究较少，无可以直接借鉴的经验。本研究对发酵培养基类型、乳糖诱导浓度、诱导时间进行探索，旨在为大规模发酵生产提供依据。

1 材料与方法

1 1 菌株、试剂及主要仪器

表达猪INH α亚基的工程菌BL21（DE3）/pRSET-INH菌株由江苏省农业科学院动物品种改良和繁育重点实验室构建并保存。胰蛋白胨、酵母粉购自英国Oxoid公司，氨苄青霉素购自美国Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯产品。种子培养基为LB，发酵培养基共3种，分别为TB培养基（胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO4 231 g/L，K2HPO4 12 54 g/L，甘油 4 mL/L）、组合培养基[葡萄糖2 g/L，胰蛋白胨 8 g/L，酵母粉 12 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO4 4 g/L，柠檬酸钠0 5 g/L，FeSO4·7H2O 0 18 g/L，CaCl2·2H2O 0 1 g/L，H3BO3 0 06 g/L，MnSO4 0 12 g/L，CuCl2·2H2O 0 01 g/L， Na2MoO4·2H2O 0 1 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0 2 g/L，ZnCl2· 7H2O 0 02 g/L]、M9培养基（葡萄糖 4 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NH4Cl 1 g/L，CaCl2 002 g/L，NaCl 0 5 g/L，Na2HPO4 12 8 g/L）。 补料培养基含大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏15 g/L，MnSO4 25 mg/L，MgSO4 5 g/L，NH4Cl 15 g/L。种子培养基在使用前加入氨苄青霉素至终浓度为60 g/L。水平恒温摇床（德国Therma公司）；20 L 全自动发酵罐系统（镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）；蛋白质垂直电泳系统（北京六一生物科技有限公司）；分光光度计（德国Eppendorf公司）。

1 2 方法

1 2 1 菌种活化及扩大培养 将冻存于-80 ℃的表达菌株划线接种于LB固体培养基平板上，37 ℃培养1 d，挑取单菌落接种于5 mL LB培养基中，37 ℃ 230 r/min振荡培养8 h后，按1 ∶ 100的比例接种于LB液体培养基中，继续振荡培养10 h作为发酵种子液。

1 2 2 发酵基本条件 发酵罐在使用前按照标准流程（过滤器消毒-部分管路消毒-空罐消毒）进行消毒灭菌处理。向灭菌后的发酵罐加入发酵罐总体积4/5的培养基（即15 L左右，但考虑到实消时会有23 L蒸馏水进入培养基造成培养基稀释，所以在配制时取15 L的培养基，加入12 L水，使发酵培养基初始浓度略高），并进行实效。实效结束，将培养基温度降至37 ℃、罐压降至0 MPa，打开加料口，在火焰下灌入无菌氨苄青霉素至终浓度为600 mg/L，同时按5%接种量接种于发酵培养基中，并添加2%的有机硅消泡剂。关闭加料口开始发酵。发酵时，温度设定为37 ℃，搅拌速度设定为 200 r/min，罐压为0 05 MPa，通风控制在11 7 L/min。通过加氨水和稀盐酸调节发酵培养基的pH值，加入的氨水可以作为氮源供细菌利用。